小鼠海马神经元中突触囊泡内吞的透射电子显微镜成像

摘要

来源：Villarreal, S.，等，在培养的海马神经元中测量突触囊泡内吞作用。J. Vis. Exp. (2017)

本视频通过辣根过氧化物酶标记和电子显微镜技术，演示了在培养的海马神经元中对突触囊泡内吞作用的分析。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

电子显微镜

1. 配制含辣根过氧化物酶（HRP）的高钾（K⁺）刺激溶液：31.5 mM NaCl、2 mM CaCl₂、90 mM KCl、25 mM HEPES（pH 7.4）、30 mM 葡萄糖、2 mM MgCl₂、0.01 mM CNQX、0.05 mM AP5 和 5 mg/mL HRP，然后用 5 M NaOH 调节至 pH 7.4。
   1. 在室温下，向每孔加入 1.5 mL 高 K⁺ 刺激溶液，刺激海马神经元培养物 90 秒（记为 K⁺）。在静息状态（记为 R）下，使用含相同浓度 HRP（5 mg/mL）的正常盐溶液处理 90 秒。对于恢复样本，先按 K⁺ 样本方式施加高 K⁺ 刺激溶液，随后迅速洗涤并更换为正常盐溶液，孵育 10 分钟。
2. 固定与染色
   
   1. 使用 21.4 g/L 的 Na cacodylate 配制 0.1 M Na cacodylate 缓冲液（pH 7.4）。用含 4% 戊二醛的 0.1 M Na cacodylate 缓冲液在室温下固定细胞至少 1 小时。用 0.1 M Na cacodylate 缓冲液洗涤三次，每次 7 分钟。
   2. 配制二氨基联苯胺（DAB）溶液：将 0.5 mg/mL DAB 溶于含 0.3% H₂O₂ 的 ddH₂O 中，并用 0.22 µm 滤膜过滤。每孔加入 1.5 mL DAB 溶液，在 37 °C 孵育 30 分钟。用 0.1 M Na cacodylate 缓冲液洗涤三次，每次 7 分钟。
      注意：DAB 具有毒性且为疑似致癌物，请佩戴手套和实验服操作。
      说明：DAB 标记依赖于 HRP 催化 H₂O₂ 对其进行氧化。各组分浓度的微小增加均会导致样本信号增强。提高 HRP 浓度可加快催化反应速度。但 H₂O₂ 浓度过高会引发对 HRP 的破坏性副反应，抑制标记效果³²。本研究中，该标记系统的各组分浓度基于现有研究成果确定。
   3. 后固定：在 4 °C 条件下，用 1.5 mL 含 1% OsO₄ 的 0.1 M Na cacodylate 缓冲液孵育神经元 1 小时。用 1.5 mL 0.1 M Na cacodylate 缓冲液洗涤三次，每次 7 分钟。
      注意：由于 OsO₄ 具有毒性和高反应活性，在多数情况下建议将样本置于冰上并在通风橱中孵育，而非使用冰箱。
   4. 配制 0.1 M 醋酸钠缓冲液：每升含 13.61 g 醋酸钠和 11.43 mL 冰醋酸，调节 pH 至 5.0。用 1.5 mL pH 5.0 的 0.1 M 醋酸盐缓冲液洗涤三次，每次 7 分钟；随后在 4 °C 条件下，用 1.5 mL 含 1% 醋酸铀的 pH 5.0 醋酸盐缓冲液孵育 1 小时。再用 1.5 mL 0.1 M 醋酸盐缓冲液洗涤三次，每次 7 分钟。
      
3. 环氧树脂包埋
   
   1. 在通风橱中，依次用 1.5 mL 的 50%、70% 和 90% 乙醇各洗涤一次，每次 7 分钟；再用 1.5 mL 100% 乙醇洗涤三次，每次 7 分钟，以完成神经元培养物的脱水。
   2. 将 485 mL/L 双酚-A-（表氯醇）环氧树脂、160 mL/L 十二烯基琥珀酸酐（DDSA）、340 mL/L 甲基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸酐（NMA）和 15 mL/L 2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚（DMP-30）混合，配制成环氧树脂。充分混匀后，在真空条件下储存以去除气泡。
      说明：必须彻底去除树脂中的气泡，尤其是肉眼不可见的微小气泡，因为它们在切片过程中可能导致树脂内部形成空腔。
   3. 在摇床上，于室温下用含 50% 环氧树脂的乙醇溶液置换乙醇，孵育 30 分钟；再用含 70% 环氧树脂的乙醇溶液继续孵育 30 分钟，完成样本浸润。
   4. 更换为 100% 环氧树脂溶液，在 50 °C 孵育 10 分钟。随后更换两次新鲜的 100% 环氧树脂，每次在 50 °C 孵育 1 小时。加入新鲜 100% 环氧树脂后，先在 50 °C 过夜硬化，再于 60 °C 继续硬化超过 36 小时。
4. 使用珠宝匠手锯将每个样本从多孔板中取出。在倒置光学显微镜下选择细胞密集的感兴趣区域，切割成 70 至 80 nm 厚的块状样本用于切片。将切下的样本固定于超薄切片机的样品夹中并装入切片机。调整样品夹位置，安装金刚石刀，使刀刃与样本块表面平行。直接将 70 至 80 nm 厚的切片收集到单个载网上。
5. 将醋酸铀按重量溶于水配制成 1% 水溶液，另将柠檬酸铅按重量溶于水配制成 3% 水溶液。将切片依次浸入 1% 醋酸铀水溶液染色 15 分钟，再浸入 3% 柠檬酸铅水溶液染色 5 分钟，以增强样本对比度。
6. 电镜成像
   1. 使用透射电子显微镜观察切片，并用 CCD 数字相机在 10,000–20,000 倍初级放大倍数下采集图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher	21103-049	神经元生长培养基，使用前预热至 37°C
B27	Thermo Fisher	17504-044	神经元分化的添加剂
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	神经元培养的添加剂
牛胰蛋白酶 XI	Sigma	T1005	神经元培养——消化海马组织
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	D5025	神经元培养——抑制细胞悬液黏稠度
多聚赖氨酸（Poly-l-lysine）	Sigma	P4832	电子显微镜，用于神经元生长的基质，室温下在多孔板上孵育 1 小时，然后用无菌水洗涤 3 次
辣根过氧化物酶（HRP）	Sigma	P6782	电子显微镜，通过在过氧化氢存在下催化 DAB 反应标记内吞的突触小泡，终浓度为 5 mg/mL 的生理盐水溶液，使用前新鲜配制
二甲胂酸钠	Electron Microscopy Sciences	12300	电子显微镜，固定剂和洗涤用缓冲液，终浓度为 0.1 N
3,3′-二氨基联苯胺（DAB）	Sigma	D8001	电子显微镜，用于标记内吞的突触小泡，HRP 的底物，终浓度为 0.5 mg/mL 的双蒸水溶液，过滤后使用，使用前新鲜配制
过氧化氢溶液	Sigma	H1009	电子显微镜，通过诱导 HRP-DAB 反应标记内吞的突触小泡，终浓度为 0.3% 的双蒸水溶液，使用前新鲜配制
戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16365	电子显微镜，固定剂，终浓度为 4% 的二甲胂酸钠缓冲液，使用前新鲜配制，使用前充分震荡混匀
透射电子显微镜（TEM）	JEOL	200CX	电子显微镜，用于观察内吞小泡及超微结构变化
CCD 数字相机	AMT	XR-100	电子显微镜，用于图像采集
柠檬酸铅	Leica microsystems	16707235	电子显微镜，载网染色