小鼠海马神经元突触小泡内吞作用的透射电镜成像

摘要

资料来源：比利亚雷亚尔，S.，et。al.，测量培养的海马神经元中的突触囊泡内吞作用。J. Vis. Exp. （2017）

该视频演示了通过辣根过氧化物酶标记和电子显微镜分析培养的海马神经元中的突触囊泡内吞作用。

方案

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

电子显微镜

1. 用 HRP（辣根过氧化物酶）制备高 K⁺ 刺激溶液，分别为 31.5 mM NaCl、2 mM CaCl₂、90 mM KCl、25 mM HEPES （pH 7.4）、30 mM 葡萄糖、2 mM MgCl₂、0.01 mM CNQX、0.05 mM AP5 和 5 mg/mL HRP，然后用 5 M NaOH 调节至 pH 7.4。
   1.在室温下用 1.5 mL 高 K⁺ 刺激溶液（称为 K ⁺）刺激海马神经元培养物，向每个孔中加入 1.5 mL，持续 90 秒。在静息状态下（称为 R），应用相同浓度的 5 mg/mL HRP 90 秒，但使用生理盐水溶液。对于回收样品，与 K⁺ 样品一样，应用高 K ⁺ 刺激溶液，然后快速洗涤并更换为生理盐水并孵育 10 分钟。
2. 固定和染色
   
   1. 使用 21.4 g/L 二甲胂酸钠制备 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 值为 7.4。在室温下用 4% 戊二醛在 0.1 M Na 二甲胂酸盐缓冲液中固定细胞至少 1 小时。用 0.1 M 二甲胂酸盐钠缓冲液洗涤 3 次，每次 7 分钟。
   2. 制备二氨基联苯胺 （DAB） 溶液，由 0.5 mg/mL 的 DAB 和 0.3% H₂O₂ 的 ddH₂O 溶液组成，并用 0.22 μm 过滤器过滤。在 37 °C 下涂抹 1.5 mL DAB 溶液 30 分钟。用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液洗涤 3 次，每次 7 分钟。
      注意：DAB 是一种有毒的疑似致癌物。请使用手套和实验室外套。
      注意：DAB 标记是由于 HRP 催化下被 H₂O₂ 氧化而发生的。组分的微小增加会导致样品中的信号增加。增加 HRP 的浓度会加快催化剂的作用。足够高浓度的 H₂O₂ 允许与 HRP 发生使人衰弱的副反应，从而抑制标记³² 的效果。在这项工作中，该标记系统的浓度是根据当前可用的研究选择的。
   3. 将神经元与 1.5 mL 的 1% OsO₄ 在 0.1 M 二甲胂酸盐缓冲液中在 4 °C 下孵育 1 小时作为后固定。用 1.5 mL 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液洗涤 3 次，每次 7 分钟。><注意：由于 OsO₄ 的毒性和反应性，在许多情况下，将样品保存在化学罩中的冰上比使用冰箱孵育更可取。
   4. 在 pH 值为 5.0 的条件下，用 13.61 g/L 乙酸钠和 11.43 mL/L 冰醋酸制备 0.1 M 乙酸钠缓冲液。用 pH 值为 5.0 的 1.5 mL 0.1 M 乙酸盐缓冲液洗涤 3 次，每次 7 分钟，并在 4 °C 下与 1.5 mL 1% 乙酸酯在 pH 值为 5.0 的 0.1 M 乙酸盐缓冲液中孵育 1 小时。用 1.5 mL 0.1 M 乙酸盐缓冲液洗涤 3 次，每次 7 分钟。
      
3. 环氧树脂嵌入
   
   1. 用 1.5 mL 的 50%、70% 和 90% 乙醇洗涤一次，每次 7 分钟，然后在通风橱中用 1.5 mL 100% 乙醇洗涤 3 次，每次 7 分钟。
   2. 混合 485 mL/L 双酚 A-（环氧菌醇）环氧树脂、160 mL/L 十二烯基琥珀酸酐 （DDSA）、340 mL/L 甲基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸酐 （NMA） 和 15 mL/L 2,4,6-三（二甲基氨基甲基）苯酚 （DMP-30） 以制备环氧树脂。充分混合，然后在真空下储存以去除气泡。
      注意：去除树脂中的气泡至关重要，尤其是那些小于肉眼可见的气泡，因为它们会在切片过程中导致树脂中出现空腔。
   通过在
   3. 摇床上用 50% 环氧树脂的乙醇溶液在室温下替换乙醇 30 分钟，然后在振荡器上用 70% 环氧树脂的乙醇溶液替换 30 分钟来浸润样品。
   4. 用 100% 环氧树脂更换环氧树脂溶液，并在 50 °C 下孵育 10 分钟。进行两次新鲜的 100% 环氧树脂交换，并在 50 °C 下孵育 1 小时。加入新鲜的 100% 环氧树脂，在 50 °C 下硬化过夜，然后在 60 °C 下固化 36 小时以上以硬化。
4. 用珠宝商的手锯从多孔板中取出每个样品。使用倒置光学显微镜选择感兴趣的区域、致密浓度的细胞，然后切割 70 至 80 nm 的块，以便通过切片机进行切片。将切割区域安装在切片机卡盘中并加载切片机。将卡盘放在切片机中，并安装一把金刚石刀，其边缘平行于块的表面。将 70 至 80 nm 厚的切片直接收集到单个网格上。
5. 将乙酸铀酰溶于水中，得到重量为 1% 的溶液，将柠檬酸铅分别溶于水，得到重量为 3% 的溶液。用 1% 乙酸铀酰水溶液浸没 15 分钟，然后用 3% 柠檬酸铅水溶液浸泡 5 分钟，以提高样品的对比度，对切片进行复染。
6. EM imaging
   1. 用透射电子显微镜检查切片，并使用 CCD 数码相机以 10,000-20,000 倍的初级放大倍率记录图像。

材料