转基因小鼠神经炎症的生物发光成像

摘要

来源：Breid, S., 等. α-突触核蛋白纤维外周接种后转基因小鼠神经炎症的生物发光成像。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了转基因小鼠中神经炎症的生物发光成像，呈现了活化星形胶质细胞内的荧光素酶-荧光素反应。该方案可实现对星形胶质细胞活化的无创定量，有助于中枢神经系统炎症及相关治疗效果的研究。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

动物模型

1. 将半合子 Tg(Gfap-luc+/-) 小鼠与半合子 Tg(M83+/-) 小鼠杂交，以获得半合子双转基因 Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) 小鼠。
2. 采用实时 PCR 对子代进行基因分型，检测编码人源 α-突触核蛋白的转基因，同时采用标准 PCR 检测萤火虫荧光素酶。
3. 在动物六至八周龄时进行接种。

接种物制备

1. 在含有150 mM NaCl的20 mM Tris-HCl（pH 7.2）Tris缓冲盐水（TBS）中配制带有A53T突变的单体重组人α-突触核蛋白。
2. 通过在37 °C、800 rpm条件下，于圆周摇床上孵育5天，将3 µg/µL的单体重组人α-突触核蛋白转化为纤维状α-突触核蛋白用于接种。
3. 将纤维聚集体用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，使腹腔接种时终浓度达到1 µg/µL。
4. 在冰上使用棒状超声仪对α-突触核蛋白纤维进行超声处理，设置为50%振幅，每次脉冲0.5秒，间隔1秒，共40次脉冲，持续1分钟。为避免交叉接种污染，每次制备不同接种物时应使用洁净的超声探头。

腹腔注射

1. 进行腹腔注射时，将动物短暂置于麻醉舱中，以2 L/min的流速和2%的蒸发器设置，通过吸入异氟烷/氧气进行麻醉。轻捏动物脚趾，确认其后肢无回缩反应，以确保麻醉效果充分。
2. 用27 G一次性皮下注射器吸取50 µL超声处理后的α-突触核蛋白纤维或PBS。
3. 将小鼠保持在背侧卧位，头部朝向远离实验操作者并向下倾斜约45°，直接将样品注入腹腔，注意避免穿刺到腹壁后方的小肠或盲肠。持续观察动物，直至其从麻醉中恢复。

生物发光成像

1. 每2至4周使用生物发光成像系统对Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠进行成像。
2. 成像前，将小鼠置于异氟烷/氧气麻醉舱中进行短暂麻醉，气体流速为2 L/min，蒸发器浓度设定为2%。轻捏小鼠脚趾，确认其后肢无回缩反应，以确保麻醉效果充分。
3. 使用脱毛膏对小鼠头部进行剃毛和脱毛处理。用无刺激性记号笔将耳朵涂黑，以消除非特异性生物发光信号。
4. 将荧光素酶底物D-荧光素钾盐溶于PBS中，配制成30 mg/mL的储存液。分装为1 mL等份，于-20 °C保存。避免溶解后的D-荧光素暴露于光照下。
5. 注射前称量小鼠体重，根据150 mg/kg体重的剂量计算所需D-荧光素的准确注射体积。经腹腔注射D-荧光素后，将小鼠放回麻醉舱中。
6. 启动成像软件。待成像系统达到工作温度后，在控制面板中点击“Initialize”按钮以初始化系统。
7. 选择“Luminescent”和“Photograph”按钮。将曝光时间设为60秒，binning设为“Medium”，F/Stop设为“1”，EM增益设为“Off”。
8. 确认激发滤光片设置为“Block”，发射滤光片设置为“Open”，并将样品高度设为1.50 cm。
9. 注射D-荧光素后10分钟，将小鼠放置于成像舱内的加热板上，确保其鼻部正确对准麻醉气体出口。关闭吸入麻醉舱的异氟烷/氧气气流，开启成像舱的气流（流速0.25 L/min，蒸发浓度2%），并妥善关闭成像舱门。
10. 点击“Acquire”按钮开始采集生物发光信号，采集过程持续60秒。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
27号针头注射器	VWR	613-4900
异氟烷	Piramal Healthcare	PZN 4831850
脱毛膏	Veet
Secureline 实验室标记笔	Neolab	25040
D-荧光素钾盐	Acris	LK10000	30 mg/mL 储备液
恒温混匀仪	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 超声波破碎仪	巴德尔林	3648
IVIS Lumina II 成像系统	PerkinElmer
Living Image 3.0 软件	PerkinElmer
Tg(M83+/-) 小鼠或 B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J 小鼠	杰克逊实验室	4479