使用荧光脂溶性染料对 Drosophila 运动神经元进行逆行标记

摘要

来源：Inal, M. A. 等人， 逆行示踪 果蝇 使用亲脂性荧光染料标记胚胎运动神经元。 视频实验杂志 (2020)

本视频展示了利用脂溶性染料逆行标记果蝇（Drosophila）运动神经元的方法。染料进入轴突后逆向运输，使神经元呈现绿色标记，从而可在共聚焦显微镜下清晰观察其形态结构和投射路径。

方案

1. 仪器与试剂

1. 收集胚胎及训练成虫产卵所需材料
   1. 通过截断一个50 mL离心管，并在管盖上开孔，将孔径为100 µm的滤网（材料表）固定于管体与管盖之间，制备过滤装置。
      注意：也可使用孔径为100 µm的细胞筛（材料表）进行胚胎收集时的过滤步骤。
   2. 根据说明书使用葡萄培养基预混粉（材料表）制备琼脂平板。简要步骤如下：将一包粉末轻轻搅拌加入500 mL室温（RT，23 °C）蒸馏水（dH₂O）中，微波加热至剧烈沸腾。待溶液冷却至70−75 °C后，倒入培养皿（60 mm）中。琼脂凝固后，于4 °C保存备用。
   3. 将活性干酵母（材料表）与水混合成糊状，制得酵母糊，并于4 °C保存。
   4. 使用适用于60 mm培养皿的产卵笼（材料表），以保证充足的空气流通。
      
2. 解剖针与染料注射微管的制备
   1. 使用内径0.6 mm、外径1.2 mm的同一毛细玻璃管（材料表）制备染料注射微管和解剖针。使用微管拉制仪（材料表），在最大输出电压170 V下以7%的拉制程序拉制毛细管，形成尖端长度约0.4 cm的细长针头。
   2. 用于染料注射时，需使用微管斜面研磨仪（材料表）通过仪器手册中所述的气泡斜面研磨技术对微管进行修整。
      1. 简而言之，先用润湿剂（材料表）浸湿研磨面，防止水“拖拽”针尖。将微管固定于微管夹持器上，角度设为25−30°，并将针尖置于斜面表面中心向外三分之二半径处。研磨过程中，通过连接导管的注射器向微管内持续通入空气，以确保玻璃碎屑不会堵塞微管内部。
      2. 使用细头永久性记号笔在微管上做标记，以指示斜面处理后针尖开口的位置，因为该开口呈倾斜角度，难以直接观察其狭窄的开口位置。

2. 胚胎收集的准备工作

1. 确保成年果蝇（20−40只野生型Canton-S或white品系果蝇），无论雌雄，均处于年轻（<7天）且健康的状态，以获得理想的产卵效果。
   注意：为促进产卵，应在正式收集卵前数日，每天至少一次将果蝇置于含有酵母糊条带的琼脂平板上，在产卵笼中进行产卵训练。

3. 胚胎发育分期

1. 让果蝇在室温下产卵过夜（或至少15小时），以收集产卵后15小时（AEL）的胚胎，即16期，用于观察前角细胞（aCC）和原始虾3（RP3）运动神经元的树突发育。早晨时，收集带有卵的培养皿。
   注意：产卵后15小时（AEL）的胚胎将具有明显的四腔肠道。若需观察不同发育阶段，请依据其特定的形态学标准和培养条件进行。
2. 为收集胚胎，用50%次氯酸钠溶液对培养皿上的卵进行去壳处理，持续5分钟。
3. 一旦卵壳被清除，将培养皿中的内容物倒入过滤装置或细胞筛中，以分离胚胎。使用装有水的挤压瓶冲洗残留的次氯酸钠，并通过倾注混合液至滤膜上，尽可能多地收集胚胎。
4. 在滤膜上用更多水清洗胚胎3–4次，或直至次氯酸钠气味完全消散。将滤膜从装置上取下，用水将胚胎冲洗至另一个干净的培养皿中。倒掉胚胎所在新培养皿中的水。
5. 准备一块载玻片，在其中央覆盖两层乙烯基胶带，形成一个矩形区域。使用剃刀片从胶带中切出一个矩形池。在池的上端贴一条薄的双面胶带，胚胎将被放置于此处，如图1所示。
6. 使用精细镊子，单独挑选5–10个产卵后15小时（AEL）的胚胎，将其背侧朝上放置于双面胶带上。向解剖池中加入昆虫林格氏生理盐水，以防止胚胎干燥（图1）。

4. 解剖与染色

1. 在解剖显微镜下（材料表），使用玻璃针从单个胚胎的后端至前端沿其表面中线切开。然后将胚胎从胶带上的卵黄膜中拉出并置于玻璃表面（如图1中框出部分所示）。注意不要损伤胚胎内部组织。
2. 将上皮组织从中部翻起，并将表皮边缘贴附在载玻片表面（图1，插图）。
3. 使用连接毛细管、尖端开口约300 µm的针头（通过折断解剖针的细尖端制备），吸取或吹入空气以分离并移除背侧纵行气管干及任何残留的肠道组织。
4. 用含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下固定胚胎5分钟。用PBS洗涤胚胎3次。
5. 将1 µL与Cy3染料偶联的抗辣根过氧化物酶抗体（anti-HRP Cy3）（材料表）加入200 µL PBS中，孵育胚胎1小时进行染色。染色后用PBS洗涤3次。
   注意：可根据所选用的脂溶性染料种类更换anti-HRP的荧光染料。

5. 注射微移液管的填充

1. 加热亲脂性染料（5 mg/mL 的 3,3´-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐（DiO）或 1,1′-二辛基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚二羰花青-4-氯苯磺酸盐（DiD）） 材料表) 在使用前，将其置于乙醇：植物油为1:10的混合液中，从室温加热至60°C。
2. 为注射微移液管制备油溶性染料载玻片。将微移液管插入毛细管固定器中（图2，#1）。使用显微操作仪（材料表），调节微量移液器至染料载玻片上方，然后调节载物台，将微量移液器置于染料上（图2, #2).
3. 为填充微量移液器，请使用显微注射仪（材料列表) (图2，#3）。通过将P_i （注射压力）在200−500 hPa（百帕）之间，T_i （注射时间）在 0.1−0.5 s 之间和 P_c （补偿压力）调至 0 hPa，持续 5 分钟（图2, #4).
4. 染料收集完毕后，移除染料载玻片，将样品置于显微镜载物台上。随后，先将 Pc 增加至 20−60 hPa 范围，再将微量移液管插入样品中，以防止毛细作用导致 PBS 污染。

6. 神经元染料注射

1. 使用10倍物镜（材料表）在显微镜下将胚胎置于视野中央，并使微量移液管与胚胎对齐。
   注意：可通过调节Pi值或微量移液管尖端开口大小来调整染料液滴的尺寸。液滴直径应为10−20 µm，约等于一条肌纤维的宽度。
2. 将物镜更换为水浸式40倍物镜（材料表），并将镜头浸入PBS中以观察胚胎。
   1. 使用荧光显微镜观察由抗HRP Cy3标记的神经元形态，并确定注射位点。
   2. 注射过程中使用明场显微镜观察染料液滴。当胚胎处于清晰对焦状态时，调整微量移液管位置，使其尖端轻柔接触目标轴突（例如aCC、RP3）。
   3. 利用抗HRP Cy3标记的神经元，在aCC或RP3的神经肌肉接头处的右侧腹段（A2−A6）半节段中，使用DiD或DiO染料进行染料滴注（图3）。通过手控装置（鼠标；图2，5）释放染料，在滴注完成后使用显微操作器移开微量移液管，并移至下一个注射位点。
      注意：与其他可通过缝隙连接扩散至邻近细胞的染料（如荧光素黄、钙黄绿素）不同，脂溶性染料会结合于细胞膜，不会转移至相邻细胞。然而，由于染料液滴相对较大，该技术也会导致配对肌肉被标记（图3A）。
3. 染料滴注后，在室温下孵育样本1小时，再进行成像。
   注意：在封片前可在此处暂停实验流程，样本可在4 °C下保存过夜。若具备细胞内直流（DC）放大器，也可采用电泳法递送脂溶性染料。

7. 使用共聚焦显微镜进行成像

1. 使用镊子将玻璃载片上的双面胶带和乙烯基胶带移除。
2. 取一片盖玻片（22 × 22 mm²，No.1 盖玻片），在四个角落涂抹少量真空脂（材料表），然后小心地将其放置在样品上，避免产生气泡。使用擦拭纸去除多余的 PBS。
3. 轻压盖玻片，以调节物镜与样品之间的工作距离。用指甲油将盖玻片边缘完全密封。
4. 使用共聚焦显微镜在 10× 和 100× 放大倍数下进行成像。

结果

图1：解剖培养皿的设置。 玻璃载片上所见的蓝色区域由乙烯基胶带围成，用于容纳缓冲液。双面胶带用于固定排列整齐的胚胎。左下角展示了在生理盐水中解剖完成的胚胎示例。本图及后续所有图示中，胚胎前端均位于上方。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10倍物镜	Nikon		Plan
40倍水浸物镜	Nikon		NIR Apo
毛细玻璃管	Frederick Haer&Co	27-31-1
共聚焦显微镜	Andor	N/A	Dragonfly 转盘共聚焦成像系统
盖玻片	Corning		22x22 mm 方形 #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
体视显微镜	Nikon	N/A	SMZ-U
双面胶带	Scotch	665
道康宁高真空润滑脂	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-20
果蝇产卵笼	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	已停产	FemtoJet 4i (货号 5252000021)
显微操作仪	Sutter	MP-225
微电极拉针仪	Sutter	BV-10-B
拉针仪	Narishige	PC-100
Nutri-fly 葡萄琼脂预混粉末包	FlyStuff	47-102
尼龙网滤膜	Millipore
16% 电镜级多聚甲醛溶液	Electron Microscopy Sciences	15710	任何电镜级产品
PBS	Roche	11666789001	Sigma-Aldrich 销售，盒装 10 倍溶液
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	润湿剂
正置荧光显微镜	Nikon	N/A	Eclipse Ci 配备 LED 光源
乙烯基电工胶带	Scotch	6143
VWR 细胞筛	VWR	10199-659
酵母	FlyStuff	62-103	活性干酵母（RED STAR）