外周血来源细胞分化神经细胞的免疫荧光显微镜检测

摘要

来源：Becker-Kojić, Z. A.，等.，无转基因方法生成血液来源神经元细胞。J. Vis. Exp. (2021)

该视频演示了一种制备重编程外周血细胞来源的神经细胞以进行荧光显微镜观察的实验方案，通过免疫荧光成像展示不同的细胞类型及发育阶段。

方案

1. 血源性神经细胞的免疫荧光显微镜分析
   1. 将细胞培养16天并移除培养基。
      1. 使用预热的固定液孵育，固定液成分为75 mL无菌水、4 g多聚甲醛。根据需要加入10 N NaOH，搅拌至溶液澄清。然后加入10 mL 10x PBS、0.5 mL MgCl₂、2 mL 0.5 M EGTA和4 g蔗糖。用6 N HCl将pH值调至7.4，并用无菌水定容至100 mL，孵育15分钟。
      2. 弃去固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。立即加入新配制的0.3% Triton X溶液，透化细胞5分钟。用PBS洗涤3次后，加入由PBS和5% BSA配制的封闭液。
      3. 在室温下于摇床上封闭细胞1小时。
      4. 将抗体用1% BSA/PBS进行适当稀释，并在室温下于摇床上孵育细胞1.5小时。用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，然后加入DAPI孵育，最后用封片剂封片，以便在显微镜下观察。
         注意： 本实验中使用的直接标记抗体列于材料表中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗GFAP-Cy3偶联抗体	Merck Millipore	MAB3402C3
抗MAP2-Alexa Fluor 555抗体	Merck Millipore	MAB3418A5
抗Nestin-Alexa Fluor 488抗体	Merck Millipore	MAB5326A4
抗Tuj1-Alexa Fluor 488抗体	BD Pharmingen	560381
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
Multiplatte Nunclon 4孔板	Fisher Scientific	10507591
Neurobasal培养基	Gibco	10888022
无菌PBS	Roth	9143.2
多聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P4957-50ML