利用荧光寿命成像显微镜分析组织切片中的淀粉样结构

摘要

来源：Nyström, S., 等 利用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像技术对经发光共轭寡噻吩染色的淀粉样组织进行成像。 J. Vis. Exp. (2017).

本视频演示了使用荧光寿命成像显微技术（FLIM）结合hFTAA染料分析淀粉样结构，通过伪彩图像显示致密核心呈蓝/绿色，不稳定边缘呈红/黄色，反映淀粉样蛋白的组织特征。

方案

1. 组织样本的制备

注意： 多种组织类型均可使用七聚甲酰基噻吩乙酸（hFTAA）作为淀粉样蛋白标记物进行成像。hFTAA对聚集体构象具有敏感性，因此染色应优先在未破坏的聚集体上进行，避免表位暴露。为获得最佳光谱质量，应尽量减少组织固定。因此，推荐使用新鲜冷冻组织，并在染色时以乙醇轻柔固定。然而，即使在经甲醛等固定剂处理的组织中，亦可检测到淀粉样沉积物。 例如，甲醛。hFTAA 通常能很好地穿透组织。选择与预期成像技术相适应的样本厚度。

1. 若使用福尔马林固定、石蜡包埋的切片，应将其置于二甲苯中脱蜡过夜。随后将切片依次浸入99%乙醇、70%乙醇、dH₂O和磷酸盐缓冲液（PBS）中，每种溶液浸泡10分钟。让组织切片在常温条件下自然干燥。
   注意：二甲苯必须始终在化学通风橱中操作。二甲苯及其他有机溶剂具有危害性。
   1. 在室温下解冻冷冻切片。将组织切片用10%福尔马林固定过夜，然后依次浸入99%乙醇、70%乙醇、dH₂O和PBS中进行再水化，每种溶液浸泡10分钟。让组织切片在常温条件下自然干燥。
2. 将hFTAA工作液滴加至组织切片上（每片约200 µL），确保液体覆盖整个切片。液滴应依靠表面张力保持在原位。室温孵育30分钟以完成染色。
3. 用移液器吸取500 µL PBS冲洗掉染色液，然后将载玻片浸入PBS浴液中10分钟。让切片在常温条件下自然干燥。
4. 使用荧光封片剂封片。封片剂需静置过夜使其充分固化。

2. 荧光寿命成像显微术（FLIM）
注意： 共聚焦显微镜配备有荧光寿命成像显微术（FLIM）装置。

1. 设置共聚焦显微镜的以下参数：针孔，20；激发波长，490 nm；激光强度，0.5%（对应平均功率为 7.5 µW）。使用 40 MHz 的脉冲激光器。

2. 在 FLIM 软件中，设置 550 nm 以上的光子计数。在“显示参数”窗口中，持续观察光子计数，直至最大计数值约为 4,000 个光子计数。

3. 保存文件并将其导出为单光子计数（SPC）图像。

4. 在 FLIM 软件中将数据拟合为双组分指数衰减。若拟合结果的 χ² < 2，则拟合效果良好。y 轴上的数值表示对应寿命的计数数量。

5. 选择包含计数的阈值， 例如100. 按T1着色并选择寿命范围。荧光衰减依赖于hFTAA结合的淀粉样蛋白结构，已观察到300至1,000皮秒之间的荧光寿命。保存文件。

6. 使用导出选项导出原始数据，并将所需数据保存到新文件夹中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako 荧光封片剂	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000	Leica
Lumen 200	Prior
Spectraview 系统	ASI 谱成像
Spectraview 软件	ASI 谱成像
LSM780	Zeiss
Zen 2010b v6.0 软件	Zeiss
FLIM 系统	Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
可调谐激光器 In Tune	Zeiss