使用去卷积显微镜成像小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白的转运

摘要

来源：Changou, C. A., 等 使用去卷积显微镜观察小鼠原代下丘脑神经元中GLUT4蛋白转运的活体成像 视频实验杂志 (2017).

本视频展示了利用去卷积显微镜对胰岛素诱导的下丘脑神经元中GLUT4转位进行高分辨率成像，以捕捉和分析GFP-GLUT4的转运动态。

方案

1. 活体图像记录

1. 活体成像用细胞的制备

1. 在6孔板中，将表达绿色荧光蛋白标记的葡萄糖转运蛋白4（GFP-GLUT4）的野生型（WT）和CCR5基因敲除（CCR5-/-）下丘脑神经元细胞培养于已预先包被多聚-D-赖氨酸的#1.5（或厚度为0.17 mm）玻璃盖玻片上。

2. 小心使用镊子取下带有神经元的盖玻片，并谨慎地将其放置在玻璃载片上。

3. 使用精细擦拭纸去除多余的培养基/液体。将擦拭纸对折两次，小心地放置在盖玻片上方，轻轻按压擦拭纸，避免移动盖玻片。
注意：切勿用力将盖玻片压向玻片。此步骤的目的是确保在图像采集过程中，盖玻片不会因浮力作用而发生移动或漂移。

4. 将盖玻片和载玻片放置在去卷积显微镜载物台上，使盖玻片朝下，并妥善固定。此步骤旨在确保载玻片位置保持恒定，以便用户后续能够追踪同一组目标细胞。

5. 使用 60x/1.42 NA 油镜物镜观察野生型（WT）和 CCR5-/- 下丘脑神经元细胞。

6. 用 CCL5（10 ng/mL）或胰岛素（10 U/mL）处理所选细胞样本 1 分钟。在盖玻片边缘加入 1.5 µL 稀释的胰岛素。

7. 立即观察并记录所选的细胞样本。将视频记录软件设置为连续录制30分钟。

2. 去卷积显微镜成像与分析
注意：本实验步骤需要使用去卷积显微镜及专用分析软件。

1. 打开成像系统的电源，待显微镜载物台正确初始化后，再打开LED光源。

2. 在60倍、数值孔径1.42的物镜上滴加浸油（活体样品在37 °C时的折射率为1.520）。将样品载玻片放置在显微镜载物台上，使盖玻片朝向物镜，并妥善固定载玻片。

3. 使用明场或荧光照明识别目标细胞。调节焦距，直至能够清晰观察到目标细胞。切勿将物镜移出盖玻片区域，以免造成不必要的划痕。

4. 通过 GFP 信号鉴定绿色荧光蛋白偶联的葡萄糖转运蛋白 4（GFP-GLUT4）。确定用于图像采集的目标细胞。所选目标细胞的位置可被记录以供后续参考（见图 1）。

5. 针对每种目标细胞设置适当的实验参数（包括像素数、激发波长、透射百分比、曝光时间、层厚、时间间隔和总成像时间）。本实验中，GFP 信号的图像像素数设定为 512 × 512（如需更高分辨率，可设为 1,024 × 1,024）；每 5 分钟曝光时间为 0.025 至 0.05 秒。微小的横向 x、y 和 z 调整可通过推荐软件进行控制（见材料表）。

6. 将曝光参数设置为约 2,000 至 3,000 计数，以达到最大像素强度。为尽量减少荧光淬灭，请在保持曝光时间小于 1 s 的前提下，尽可能降低激发光透射百分比。对每个额外的荧光通道及每个独立的兴趣区域重复上述步骤。

7. 为每个目标细胞设置Z轴堆栈的上限和下限。可通过移动显微镜载物台，使目标细胞的顶部和底部均略微超出焦平面来实现。用户可通过设定上下限之间采集图像的数量（或通过设定每幅图像之间的距离）来调整Z轴的分辨率。

8. 使用相应的软件（本实验中为 PerkinElmer 公司的 Velocity）对图像堆栈进行去卷积处理，随后进行分析。

结果

图1：下丘脑神经元中GFP-GLUT4的荧光图像。 (A, C) 野生型（WT）下丘脑神经元中表达的GFP-GLUT4蛋白，以及 (B) CCR5-/- 下丘脑神经元中的表达。神经元经胰岛素 (A, B) 或CCL5 (C) 刺激。箭头指示在胰岛素或CCL5刺激前（-）和刺激后（+） neuritis 中的GFP-GLUT4点状结构，星号指示 (C) 中CCL5刺激前（-）和刺激后（+）细胞表面的GLUT4-GFP。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DeltaVision 去卷积显微镜	Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science)		配备60倍/1.42数值孔径油浸物镜；用于活细胞成像
SoftWorX 应用软件	Applied Precision Inc.		用于控制显微镜和 相机
VoloCITY 软件	PerkinElmer		用于分析图像
胰岛素	丹麦 Actrapid
Kimwipes	Kimberly-Clark	#FL42572A	0.17毫米厚度
12 mm 显微镜盖玻片	Deckglaser	#41001112	用于免疫染色研究
标准直头镊子	Ideal-tek		手术器械
CCL5/RANTES	R&D系统	478-MR-025	10 ng/ml
5 ml 移液管	康宁科斯特	4487	解离脑组织