来源：McLeod, F., 等. 海马啮齿类脑切片中突触密度的评估. J. Vis. Exp. (2017)。
本视频演示了一种利用共聚焦免疫荧光分析技术在海马脑切片中可视化突触标记物的方法。切片首先用靶向突前和突后标记物的一抗进行免疫染色，随后使用荧光素偶联的二抗孵育。通过共聚焦显微镜观察标记的突触标记物，根据其共定位情况评估突触结构。
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方法文章
使用免疫荧光法对小鼠海马脑片中突触进行显微分析
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2025年4月28日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。
1. 急性海马脑片制备
- 尽快取出小鼠脑组织，使用解剖刀和锋利的剪刀切开颅骨，并将其置于冰上预冷、持续通氧（95% O2，5% CO2）的高蔗糖人工脑脊液（ACSF，约100 mL）中。
- 将小鼠脑组织置于培养皿中，用手术刀去除小脑及前额叶皮层的一小部分，然后沿脑中线将脑组织纵向切分为两半。
- 将两个半脑切面朝下放置，用胶水将每侧半脑固定于振动切片机的载物台上。
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结果
表1：免疫荧光染色所用缓冲液。
| 封闭/通透缓冲液 | 浓度 |
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 一抗 | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| 一抗 | 赛默飞世尔科技 | MA1-046 | PSD-95（1:500） |
| 一抗 | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| 一抗 | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin（1:500） |
| 一抗 | Abcam | ab5392 | MAP2（1:10000） |
| 二抗 | 杰克逊实验室 | 706-545-148 | 驴抗豚鼠 Alexa Fluor 488（1:600） |
| 二抗 | Abcam | ab175470 | 驴抗兔 Alexa Fluor 568（1:600） |
| 封片剂 | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| 共聚焦显微镜 | Olympus | NA | 使用60倍、数值孔径（NA）为1.35的油镜，在FV1000共聚焦显微镜上进行成像。对于vGlut1，采用488激光，功率设置为14%；对于PSD-95，采用559激光，功率设置为20%。 |
| 分析软件 | PerkinElmer | NA | Volocity |
| 手术刀 | Swann-Morton | 203 | 11号 |
| 超级胶水 | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2，5% CO2 | BOC | NA | 圆柱体 |
| 24孔板 | 康宁 | 3524 | |
| 载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 7107 | 08-1.0毫米厚 |
| 培养皿 | 康宁 | 430167 | |
| iDkk1 小鼠 | N/A | N/A | 通过将 tetO Dkk1 转基因小鼠与 CaMKIIα rtTA2 转基因小鼠杂交获得实验小鼠。tetO Dkk1 转基因小鼠与 CaMKIIα rtTA2 转基因小鼠以杂合状态进行杂交。两种小鼠品系均在 C57BL/6J 背景下繁育。单转基因小鼠及野生型同窝小鼠用作对照。 |
| 溶液配制试剂： | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| MgCl₂2 | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| 犬尿喹啉酸 | Sigma | K3375 | |
| NaHCO₃3 | Sigma | S5761 | |
| 丙酮酸 | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-葡萄糖 | Sigma | G5767 | |
| 蔗糖 | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| 驴血清 | 默克密理博 | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
