使用免疫荧光法对小鼠海马脑片中突触进行显微分析

摘要

来源：McLeod, F., 等. 海马啮齿类脑切片中突触密度的评估. J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了一种利用共聚焦免疫荧光分析技术在海马脑切片中可视化突触标记物的方法。切片首先用靶向突前和突后标记物的一抗进行免疫染色，随后使用荧光素偶联的二抗孵育。通过共聚焦显微镜观察标记的突触标记物，根据其共定位情况评估突触结构。

方案

所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 急性海马脑片制备

1. 尽快取出小鼠脑组织，使用解剖刀和锋利的剪刀切开颅骨，并将其置于冰上预冷、持续通氧（95% O₂，5% CO₂）的高蔗糖人工脑脊液（ACSF，约100 mL）中。
2. 将小鼠脑组织置于培养皿中，用手术刀去除小脑及前额叶皮层的一小部分，然后沿脑中线将脑组织纵向切分为两半。
3. 将两个半脑切面朝下放置，用胶水将每侧半脑固定于振动切片机的载物台上。
4. 对目标区域进行200–300 µm厚的连续切片。以海马为例，每侧半脑可获得约3–4片切片。
5. 使用塑料巴斯德吸管将脑片转移至盛有持续通氧（95% O₂，5% CO₂）ACSF的孵育槽中，在34 °C条件下孵育30分钟。
   注意：在此阶段，可通过向孵育槽中添加重组Dickkopf-1（Dkk1）蛋白等药理学活性试剂，对脑片进行相应处理。
6. 使用画笔将脑片从孵育槽中取出，放入24孔板中，用含4%多聚甲醛（PFA）和4%蔗糖的溶液在室温（RT）下固定20分钟至1小时。
   注意：PFA具有毒性，操作时需佩戴适当的防护装备。
7. 用1X磷酸盐缓冲液（PBS）清洗脑片三次，每次10分钟。
   注意：本实验流程可在此处暂停1–2天，只要将脑片保存在4 °C的1X PBS中即可。

2. 突触标志物的免疫荧光染色

注意： 所用缓冲液的配方均可在 表1 中找到。

1. 在切片孔中，用封闭/通透缓冲液（表1）替换PBS，于室温孵育4–6小时。
2. 将针对囊泡型谷氨酸转运蛋白1（vGlut1）的多克隆豚鼠抗体用封闭/通透缓冲液按1:2,000比例稀释。
   注意：vGlut1是用于观察突触前兴奋性终末的标志物。若需鉴定突触后兴奋性突触，可使用针对突触后密度蛋白95（PSD-95）的多克隆抗体，并以1:500比例用相同溶液稀释。每孔至少使用300 µL。为确定海马的解剖位置，可使用能够标记神经元结构的抗体，例如微管相关蛋白2（MAP2）或微管蛋白（Tubulin）。应预先确定所选突触标志物（突触前和突触后）一抗的合适浓度，并将其稀释于新鲜的封闭/通透缓冲液中。
3. 将切片置于一抗溶液中，在4 °C下孵育过夜（或1–2天），使用振荡平台并保持剧烈振荡。
4. 用PBS洗涤切片三次，每次10分钟。
5. 将相应的二抗按1:500比例用封闭缓冲液稀释。例如，当使用vGlut1豚鼠抗体时，应加入识别豚鼠成分的二抗（例如，驴抗豚鼠），并偶联特定荧光染料；当使用PSD-95兔抗体时，应加入识别兔成分的二抗（例如，驴抗兔），并偶联另一种特定荧光染料。
6. 将切片在该溶液中于室温孵育2–3小时。注意避光，因二抗对光敏感。
7. 用PBS洗涤切片三次，每次10分钟。
8. 使用画笔小心地将切片从24孔板中取出，均匀地放置在预先标记的载玻片上。在每一片切片上滴加一滴封片剂，然后轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡。注意使用足量的封片剂（300–400 µL），以免因用量不足导致切片干燥。
9. 于室温下避光干燥至少1–2天。
10. 短期保存可将载玻片存放于4 °C，长期保存则应置于-20 °C。

3. 共聚焦图像采集与分析

1. 使用共聚焦激光扫描显微镜进行成像。
   1. 通过10倍或20倍物镜确定待成像的海马区域（例如，cornu ammonis 1和3（CA1、CA3）或齿状回（DG））。
   2. 切换至40倍或63倍油浸物镜，通过识别连续的神经突和有序结构来确认切片解剖结构的完整性。使用神经元标记物（如MAP2）作为参考（图1A）。
   3. 随后切换至60倍油浸物镜（数值孔径[NA] = ~1.3 - 1.4），并调整各通道设置以获得最佳信号和对比度。使用高/低对比度选项调节每台激光器的强度，避免任何像素出现饱和。
      注意：这些设置取决于所使用的显微镜型号，可参考材料表中的激光功率设置。为获得最佳结果，建议使用1024 × 1024像素的分辨率。在同一实验的不同条件下，设置应保持一致。如有需要，可应用额外的放大倍数。
   4. 评估染色均匀的深度，并采集至少8个等距（250 nm）层面的图像堆栈。然后从每张切片的同一感兴趣区域获取3个相邻的代表性图像堆栈。
      注意：深度可能因切片而异，但应始终距离切片表面约2 - 5 µm。
   5. 每种条件至少在3张切片上重复采集，并每组处理动物取6 - 8只动物的数据。

表1：免疫荧光染色所用缓冲液。

封闭/通透缓冲液	浓度	备注
驴血清	10%
Triton-X	0.50%
PBS	1x
10x PBS		pH 调至 7.4
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM
KH2PO4	18 mM
4% PFA/4% 蔗糖		pH 调至 7.4
PBS	1x	从 10x 稀释
PFA	1.33 M
蔗糖	117 mM

结果

表1：免疫荧光染色所用缓冲液。

封闭/通透缓冲液

浓度

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vibratome	Leica	VT1000S
一抗	Millipore	AB5905	vGlut1 (1:2000)
一抗	赛默飞世尔科技	MA1-046	PSD-95（1:500）
一抗	Synaptic Systems	131 004	vGAT (1:500)
一抗	Synaptic Systems	147011	Gephyrin（1:500）
一抗	Abcam	ab5392	MAP2（1:10000）
二抗	杰克逊实验室	706-545-148	驴抗豚鼠 Alexa Fluor 488（1:600）
二抗	Abcam	ab175470	驴抗兔 Alexa Fluor 568（1:600）
封片剂	SouthernBiotech	00-4958-02	Fluoromount-G
共聚焦显微镜	Olympus	NA	使用60倍、数值孔径（NA）为1.35的油镜，在FV1000共聚焦显微镜上进行成像。对于vGlut1，采用488激光，功率设置为14%；对于PSD-95，采用559激光，功率设置为20%。
分析软件	PerkinElmer	NA	Volocity
手术刀	Swann-Morton	203	11号
超级胶水	Loctite	1446875
95% O2，5% CO2	BOC	NA	圆柱体
24孔板	康宁	3524
载玻片	赛默飞世尔科技	7107	08-1.0毫米厚
培养皿	康宁	430167
iDkk1 小鼠	N/A	N/A	通过将 tetO Dkk1 转基因小鼠与 CaMKIIα rtTA2 转基因小鼠杂交获得实验小鼠。tetO Dkk1 转基因小鼠与 CaMKIIα rtTA2 转基因小鼠以杂合状态进行杂交。两种小鼠品系均在 C57BL/6J 背景下繁育。单转基因小鼠及野生型同窝小鼠用作对照。
溶液配制试剂：
NaCl	Sigma	V800372
KCl	Sigma	P9333
Na2HPO4	Sigma	255793
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	223506
MgCl₂2	Sigma	M9272
NaH2PO4	Sigma	71505
犬尿喹啉酸	Sigma	K3375
NaHCO₃3	Sigma	S5761
丙酮酸	Sigma	107360
EDTA	Sigma	E6758
D-葡萄糖	Sigma	G5767
蔗糖	Sigma	S8501
Triton-X	Sigma	T8787
驴血清	默克密理博	S30-100ml
PFA	Sigma	P6148