使用免疫荧光对小鼠海马切片中的突触进行显微分析

摘要

资料来源：McLeod， F.， et al。海马啮齿动物脑切片中突触密度的评估。J. Vis. Exp. （2017）.

本视频演示了一种使用共聚焦免疫荧光分析可视化海马脑切片中突触标志物的方法。切片用靶向突触前和突触后标志物的一抗进行免疫染色，然后用荧光团偶联的二抗进行免疫染色。然后使用共聚焦显微镜对标记的标记物进行可视化，以通过它们的共定位来评估突触结构。

方案

所有涉及动物样本的程序都已经过适当的动物伦理审查委员会的审查和批准。

1.急性海马切片制备

1. 尽快取出小鼠大脑，用抹刀和锋利的剪刀剪开头骨，放入冰冷、含氧（95% O_2,5% CO₂）、高蔗糖人工脑脊液（ACSF，~100 mL）中。
2. 将小鼠大脑放在培养皿上，用手术刀切除小脑和一小部分额叶皮层，然后沿着大脑的中线进行半切分。
3. 将两个半球放在刚刚切割的一侧，然后将每个半球粘在振动切片机的舞台上。
4. 切下整个感兴趣区域的 200 - 300 μm 厚的切片。在海马体的情况下，每个半球应获得大约 3 - 4 个切片。
5. 使用塑料巴斯德移液管，将切片转移到浸没在含氧（95% O₂、5% CO₂）ACSF 中的腔室中。在 34 °C 下保持 30 分钟。
   注意：在此阶段，可以通过将试剂添加到切片室中，用活性药物（如重组 Dickkopf-1 （Dkk1） 蛋白）处理切片。
6. 用画笔从腔室中取出切片，放入 24 孔板中，并在室温 （RT） 下在 4% 多聚甲醛 （PFA）/4% 蔗糖中固定 20 分钟至 1 小时。
   注意：PFA 有毒，请佩戴适当的防护装置。
7. 用 1X 磷酸盐缓冲盐水（PBS，每次 10 分钟）洗涤切片 3 次。
   注意：只要切片在 4 °C 的 1X PBS 中保持，该方案可以在此处暂停 1 - 2 天。

2. 突触标记物的免疫荧光

注意：使用的所有缓冲液的配方都可以在表 1 中找到。

1. 在切片孔中，用封闭/透化缓冲液（表 1）替换 PBS，并在室温下孵育 4 - 6 小时。
2. 在封闭/透化缓冲液中以 1：2,000 稀释度稀释针对囊泡谷氨酸转运蛋白 1 （vGlut1） 的多克隆豚鼠抗体。
   注意：vGlut1 是突触前兴奋性末端可视化的标志物。对于突触后兴奋性突触鉴定，使用针对突触后密度 95 （PSD-95） 的多克隆抗体，并在同一溶液中以 1：500 稀释。每个孔中使用最小体积为 300 μL。要确定海马体的解剖位置，请使用也可以识别神经元结构的抗体，例如微管相关蛋白 2 （MAP2） 或微管蛋白。为所选突触标志物（突触前和突触后）确定所有一抗的正确浓度，并在新鲜的封闭/透化缓冲液中稀释。
3. 将切片在一抗溶液中于 4 °C 孵育过夜（或 1 - 2 天）。使用剧烈运动的摇动平台。
4. 在 PBS 中清洗切片 3 次（每次 10 分钟）。
5. 封闭缓冲液中以 1：500 稀释适当的二抗。例如，当使用 vGlut1 豚鼠抗体时，使用可识别与特定荧光基团偶联的豚鼠成分（例如，驴抗豚鼠）的二抗。使用 PSD-95 兔抗体时，使用可识别与不同特异性荧光基团偶联的兔组分（例如，驴抗兔）的二抗。
6. 在室温下将切片在该溶液中孵育 2 - 3 小时。确保切片避光，因为二抗对光敏感。
7. 在 PBS 中清洗切片 3 次（每次 10 分钟）。
8. 用画笔小心地从 24 孔板中取出切片，并将它们均匀地放在预先标记的载玻片上。在每个切片的顶部加入一滴封固剂，然后轻轻地将玻璃盖玻片放在切片的顶部。避免形成气泡。注意使用足够的封固剂 （300-400 μL），因为量不足可能会导致切片干燥。
9. 在 RT 下晾干至少 1 - 2 天，并保持载玻片避光。
10. 短期将载玻片储存在 4 °C，但要长期储存，请将其保持在 -20 °C。

3. 共聚焦图像采集和分析

1. 使用共聚焦激光扫描显微镜成像。
   1. 识别要成像的海马区域（例如，山茱萸 1 和 3 （CA1， CA3） 或齿状回 （DG）） 通过 10 倍或 20 倍物镜。
   2. 更改为 40 倍或 63 倍油浸物镜，通过识别连续的神经突和有组织的结构来确保切片解剖结构完好无损。使用神经元标记物，例如 MAP2 作为参考（图 1A）。
   3. 随后，切换到 60 倍油浸物镜（数值孔径 [NA] = ~1.3 - 1.4）并调整每个通道的设置以获得最佳信号和对比度。使用高/低对比度选项来设置每个激光的强度，以避免任何像素的饱和。
      注意：这些设置将取决于所使用的显微镜，但有关激光功率设置，请参阅材料表。为获得最佳效果，请使用 1024 x 1024 像素的分辨率。在同一实验的不同条件下，设置应保持不变。如果需要，可以应用其他缩放。
   4. 评估染色均匀的深度，并获取至少 8 个等距 （250 nm） 平面的图像堆栈。然后每个切片从相同的感兴趣区域获取 3 个相邻的代表性图像堆栈。
      注意：深度可能因切片而异，但应始终与切片表面保持约 2 - 5 μm 的距离。
   5. 每个条件至少 3 个切片重复采集，每个处理组 6 - 8 只动物。

表1：用于免疫荧光染色的缓冲液。

KH₂PO₄

阻塞/透化缓冲区	集中	注释
驴血清	10%
Triton-X	0.50%
PBS	1x
10x PBS		pH to 7.4
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM
18 mM		4% PFA/4% 蔗糖		pH 值至 7.4
PBS	1x	稀释 10x
PFA	1.33 M
蔗糖	117 mM

<td style='border：1pt solid #000000;padding：5pt;vertical-align：top;'>

结果

表 1：用于免疫荧光染色的缓冲液。

阻塞/透化缓冲区 <td style='border：1.0pt solid black;padding：5.0pt;vertical-align：top;width：156.0pt;'>

材料