器官型脑切片培养中少突胶质细胞内线粒体运动的共聚焦成像

摘要

来源：Kennedy, L. H., 等人 利用腺相关病毒和共聚焦显微镜对脑片中少突胶质细胞细胞器进行可视化与活体成像 视频实验杂志 (2017)

本视频展示了在小鼠脑片组织切片中少突胶质细胞线粒体的成像过程。将脑片置于具有持续液体循环和温度控制的灌流室中。在设置共聚焦显微镜的各项参数后，首先采集呈红色荧光的线粒体的时间序列图像，随后采集呈绿色荧光的少突胶质细胞的Z轴层扫图像。

方案

1. 器官型切片的制备

注意：本实验方案使用出生后第7至9天（p7-9）的两只小鼠幼崽，可制备24片器官型脑片，分置于两个六孔培养板中。除非另有说明，所有操作均应在无菌操作台中进行，并佩戴丁腈或乳胶手套。所有试剂均应为细胞培养级。

1. 使用已高压灭菌的瓶子、解剖工具（1 把大剪刀、1 把小剪刀、1 把大平头解剖刀、1 把小圆头且锋利的解剖刀和 1 把镊子；详见材料清单）、玻璃移液管、移液器吸头和灭菌纸巾进行脑片制备。
2. 由于一半的玻璃移液管需使用大开口端，需折断其狭窄端。
   1. 如有金刚石刻线笔，可在移液管开始变窄处下方用其绕管身划一圈。然后将移液管尖端插入腈手套或类似材料中，通过在实验台面上推压并弯曲移液管，小心折断尖端。
   2. 随后，通过在砂纸上摩擦或在本生灯上轻微熔化，使折断端变钝。折断后的移液管用于转移切割后的脑片，使用时将折断端插入橡胶吸球，大开口端接触溶液或脑片。
      注意：此步骤无需在无菌操作台中进行，可提前数天完成。
3. 准备培养皿。
   注意：此步骤可在切片前一天或至少切片前 2 小时完成。
   1. 对聚四氟乙烯（PTFE）膜（“confetti”）进行灭菌。使用两把无菌镊子从周围的蓝色塑料片中取出单个 confetti。然后将其浸入含 96% 乙醇（EtOH）的培养皿中两次以进行灭菌。随后将 confetti 平放于无菌大培养皿中晾干。
      注意：confetti 为亲水性 PTFE 膜，类似于培养插件中的膜。使用 confetti 有助于活体成像，因为可通过镊子夹起 confetti 将单个脑片轻松从插件转移至显微镜装置（详见步骤 4.8）。或者，脑片也可在无 confetti 的情况下培养（此时脑片直接附着于培养插件的膜上）。在此情况下，必须使用手术刀切割膜插件以将脑片转移至显微镜灌流槽中。
   2. 向六孔培养板的每孔中加入 1 mL 培养基。
   3. 使用无菌镊子将一个培养插件放入每孔中。避免插件与培养基之间产生气泡。
      注意：为节约成本和保护环境，可重复使用培养插件。方法为用去离子水（dH₂O）彻底冲洗，随后在 70% EtOH 中孵育至少 24 小时，直至再次使用。准备新培养时，将插件置于细胞培养板中，在紫外光（UV）下干燥 15–30 分钟。
   4. 在每个培养插件上放置两个（已灭菌且干燥的）confetti。将 confetti 置于插件边缘，以尽量减少重叠。
   5. 将培养板放入 37 °C、5% CO₂ 的细胞培养箱中。
4. 用混合气体（95% O₂/5% CO₂）对冷解剖液进行鼓泡。为保持溶液无菌，将气瓶连接至带无菌注射器滤器（孔径 0.22 µm）的管路。
   1. 将注射器滤器的另一端连接至与无菌玻璃移液管相连的无菌管。将玻璃移液管插入溶液中，用封口膜覆盖，并打开气体。将解剖液置于冰上保存。
5. 准备解剖/切片区域。
   注意：理想情况下，此操作应在无菌操作台中进行。若无法实现，可将振动切片机置于实验台上。此时建议佩戴发网和口罩。
   1. 使用单边剃须刀片切取一块矩形琼脂糖凝胶（约 2 cm × 0.5 cm），并将其粘贴至振动切片机载物台上，使长边朝向切片刀。
   2. 用 70% EtOH 清洁所有表面及振动切片机部件，并用高压灭菌的纸巾擦拭。
      注意：所有将与脑组织接触的部件必须完全干燥，因为乙醇可能损伤细胞。
   3. 将无菌刀片安装至振动切片机上，并进行振动检测，以确认设备是否具备此功能。
   4. 在操作台内放置高压灭菌的解剖工具、高压灭菌的纸巾、四个小培养皿、圆头手术刀、两个带橡胶吸球的玻璃移液管、两个开口玻璃移液管（见步骤 1.1）以及经乙醇喷雾消毒的超级胶水。
   5. 将已鼓泡的解剖液倒入振动切片机槽及四个小培养皿中。
      注意：此步骤仅在解剖前立即进行，因为此后该培养基不再鼓泡或置于冰上。
6. 解剖并固定脑组织。
   注意：为获得健康的脑片，此步骤必须快速且精确地完成，需一定练习。
   1. 通过颈椎脱位或根据当地指南处死动物 #1，然后用大剪刀断头。
   2. 使用小而锋利的剪刀，从颈部至鼻部做矢状切口，快速剪开皮肤并将其掀开以暴露颅骨。
      1. 沿矢状缝剪开，随后在额骨内侧部分和人字缝（大脑与小脑的边界）处做横向切口。
      2. 用镊子将颅骨两侧掰开。将圆头且锋利的解剖刀插入脑腹侧下方，轻轻向外侧移动，以切断脑部的颅神经。
   3. 使用单边剃须刀片在小脑前方做冠状切口。
      注意：此切口将决定脑片切割的角度，因此应保持垂直。
   4. 将脑组织翻出颅骨，放入盛有解剖液的小培养皿中。
   5. 对动物 #2 重复步骤 1.6.1–1.6.4，并将该脑组织放入第二个培养皿中。
      注意：动物本身并非无菌。在操作台一侧完成解剖后，将脑组织从颅骨取出后移至另一侧洁净区域。
   6. 更换手套。
   7. 将脑组织固定至振动切片机载物台：在已固定的琼脂糖凝胶前方的载物台上涂抹一层薄薄的超级胶水。用大平头解剖刀夹持脑 #1，使新鲜切面（尾侧）接触解剖刀，腹侧朝向琼脂糖凝胶并尽可能贴近。
      1. 然后用镊子将脑组织从解剖刀上轻轻推入胶水中。确保为脑 #2 留出足够空间。
         注意：脑组织必须牢固粘附于载物台，但胶水不宜过多，以免阻碍切割。
   8. 在固定脑 #1 后立即使用大平头解剖刀在脑组织表面滴加数滴解剖液。这可保持脑组织湿润、加速胶水固化，并防止其粘附于脑组织侧面。
   9. 对脑 #2 重复步骤 1.6.7 和 1.6.8。
   10. 将载物台安装至振动切片机槽中。
7. 以 1–1.5 mm 的振幅、85 Hz 的频率和 0.2 mm/s 的速度切割 230 µm 厚的冠状脑片。收集切片位置约为前囟前 1.4 mm 至前囟后 2.1 mm。
   1. 每切一片后，使用开口玻璃移液管（步骤 1.1）收集切片。将切片转移至盛有解剖液的培养皿中。使用圆头手术刀将切片切成两半，分离左右半球。
8. 所有切片切割完成后，将切片放入培养皿中。
   1. 将培养皿（一次一个）从培养箱中取出。
   2. 使用开口玻璃移液管，小心地将一片脑片转移至每片 confetti 上。
      注意：脑片应平放于 confetti 中央。这需要一定技巧。然而，若部分脑片未完全居中，与其花费时间调整，不如保留原位，因为尽快将所有脑片放入培养箱至关重要。
   3. 使用玻璃移液管（尖端）轻轻吸除多余培养基，避免接触脑片。
      注意：培养期间脑片不应浸没于液体中。因此必须吸除多余液体，使脑片暴露于空气中（仅保留一层薄薄的液体覆盖）。长期浸没于液体中的脑片通常会不健康或死亡（参考文献 4 及我们的观察）。
   4. 当所有 confetti 均放置一片脑片后，将培养皿放回培养箱。
   5. 对培养皿 #2 重复步骤 1.7.8–1.8.4。
9. 更换培养基。
   注意：此操作应在切片后第二天（体外第 1 天，DIV1）进行，之后每 2–3 天更换一次。
   1. 将培养基在水浴或培养箱中预热。
   2. 在无菌操作台中，使用真空抽吸装置或带无菌吸头的普通移液器从每孔中吸除培养基。操作时轻轻倾斜培养皿（约 30 度），将移液器吸头置于培养插件边缘。
   3. 从每孔中吸除约 800 µL 培养基（仅保留足够覆盖插件底部的液体）。然后使用洁净移液器向每孔加入 800 µL 预热的培养基。最后将培养皿放回细胞培养箱中。

2. 病毒转导

1. 购买或制备携带目的质粒的腺相关病毒（AAV）。
   注意：本方案描述了使用血清型为2/8的腺相关病毒（AAV 2/8），其携带在线粒体靶向的dsred或GFP作为报告基因，并由髓鞘碱性蛋白启动子12（myelin basic protein promoter12）驱动表达（AAV2/8 MBP_mito_dsred 或 AAV2/8 MBP_mito_GFP），用于可视化少突胶质细胞中的线粒体。同时使用由通用CAG启动子驱动表达GFP或tdtomato作为报告基因的AAV 2/8（AAV 2/8 CAG_GFP 或 AAV 2/8 CAG_tdtomato），用于可视化少突胶质细胞的细胞质。因此，将AAV2/8 MBP_mito_dsred与AAV 2/8 CAG_GFP联合使用可在少突胶质细胞中实现红色线粒体和绿色细胞质的标记，而将AAV2/8 MBP_mito_GFP与AAV 2/8 CAG_tdtomato联合使用则可实现绿色线粒体和红色细胞质的标记。这些载体的详细信息在其他文献中有更详细的描述13。
2. 在体外培养第7天（DIV7），用AAV对少突胶质细胞进行转导。
   注意安全：操作AAV时应遵守相关安全规定，确保接受过适当培训并获得相应的生物安全等级许可。以下所有步骤均应在II级生物安全柜中进行，并佩戴手套和实验服。此处描述的是将AAV应用于脑片皮层区域的方法，因为该区域恢复效果最佳。
   1. 将AAV稀释于预热（37 °C）的培养基中。建议稀释至约2 × 10⁹ 基因组拷贝/mL（GC/mL），以实现少突胶质细胞的稀疏转导，从而便于对脑片内单个细胞进行成像。然而，应通过预实验测试不同滴度，以确保转导的少突胶质细胞密度适合特定实验需求。若使用两种不同的AAV，应将其混合于同一溶液中，并同时加入脑片。
   2. 向每一片脑片加入约1.3 µL稀释后的AAV。确保移液枪头外壁干燥。吸取1.3 µL稀释后的AAV，将枪头置于皮层上方尽可能接近但不接触脑片的位置（距离约1 mm）。
   3. 然后缓慢将溶液从移液枪中推出。当溶液接触到脑片时，移动枪头在皮层上移动，使溶液均匀覆盖整个皮层区域。
      注意：该操作应尽快完成，以避免脑片在超净台外暴露时间过长。每次仅处理一个培养皿，在开始处理第二个培养皿前，应先将第一个放回培养箱。要实现AAV的良好分布且不损伤组织，需要一定的练习和稳定的操作手法。
3. 如果细胞实验室配备有直立式荧光显微镜，可在培养期间将培养皿置于显微镜下检测蛋白表达情况。
   注意：培养皿在培养箱外停留时间不应超过2至5分钟。

3. 时间序列成像

注意：当荧光标记的表达水平足够且脑片状态良好时（通常为体外培养第11至14天），即可进行成像。

1. 确保显微镜、灌流和加热系统正确设置，使通入气泡的成像溶液被加热后能够流入和流出浴槽。
   注意： 浴槽有多种解决方案，此处展示一种简易版本。
   1. 使用钝化的注射器针头（弯曲约45°）作为灌流槽的进液口和出液口，并用蓝丁胶/趣味橡皮泥将其固定在灌流槽侧面。
   2. 确保管路从装有持续通气成像溶液的瓶子经由蠕动泵，穿过加热装置的加热管，最后连接至浴槽中的进样注射器针头。
   3. 将另一根导管连接至注射器针头出口，该导管经由蠕动泵后返回成像溶液瓶（或连接至废液瓶）。
2. 含生物氧化气体的气泡成像溶液
   注意： 这一步骤应在成像开始前至少15分钟启动，并在整个实验过程中持续进行。
3. 打开蠕动泵和加热器，使溶液流经浴槽以达到最佳浴温（37 ± 0.5 °C）。确保连接至温度控制单元的温度计传感器浸没在浴槽溶液中。
4. 打开显微镜、荧光灯和相应的激光器。
5. 为样品设置合适的光路。
   注意： 这将根据显微镜的配置和探针的不同而有所变化。使用共聚焦显微镜的一般知识是必需的，但不在本文中讨论。
6. 使用合适放大倍数和数值孔径（n.a.）的水浸物镜。我们采用40倍水浸平场复消色差物镜（n.a. 1.0）。
7. 打开针孔，以获得约2 - 2.5 µm的光学切片厚度用于延时视频。这可减少延时过程中线粒体移出焦平面的情况。
8. 将器官型脑片转移至灌流槽中：
   1. 在小型塑料培养皿中加入一滴成像溶液或培养基。
   2. 在无菌操作台中，使用无菌镊子将一个实体组织切片从膜插件转移至液滴中。镊子应仅接触滤纸边缘，不得接触切片本身。
   3. 将培养皿盖上盖子。
   4. 立即将含有剩余切片的培养皿放回培养箱中。
   5. 将含有切片的培养皿带到显微镜下。
   6. 关闭蠕动泵，然后将脑片转移至显微镜浴槽中。首先，用镊子将带有脑片的碎屑从培养皿转移至浴槽顶部（碎屑会漂浮在液面）。随后，将镊子的两个尖端分别置于碎屑两侧，使其接触碎屑但不接触脑片，推动碎屑穿过溶液沉降至浴槽底部。将碎屑置于浴槽中央位置。
   7. 使用镊子将固定锚（harp）放置在confetti上方，注意不要触碰脑片。
      注意： 竖琴状锚具是一种马蹄形铂金固定器，用于防止脑片在灌流槽中漂浮或移位。对于急性脑片，竖琴状锚具上装有细丝，从一端延伸至另一端（形似音乐竖琴）。对于器官型脑片，应使用无细丝的竖琴状锚具，并使其尺寸与碎片大小相匹配，从而能够覆盖在碎片上方而不接触脑片本身。
   8. 重新打开蠕动泵。
9. 将物镜降至样品位置。
10. 选择要成像的细胞和区域。
    注意： 避免细胞过度暴露于激光光线下，因为这可能导致细胞毒性（参见下文提示中的建议）。
    1. 使用目镜和荧光灯寻找形态健康且表达正确的少突胶质细胞。通常，荧光蛋白过表达较强的少突胶质细胞会呈现不健康状态。不健康的少突胶质细胞其突起呈团块状，线粒体则表现为断裂状。健康的少突胶质细胞胞体和突起形态平滑，线粒体长度各异（尽管通常远短于神经元和星形胶质细胞中的线粒体）。
    2. 将目标细胞置于视野中央。
    3. 使用软件中的“live”功能（适用于 Leica 和 Zeiss 显微镜）在屏幕上识别细胞，并选择感兴趣的区域，例如包含多个初级突起或髓鞘的细胞部分，或单个突起或髓鞘。
       注意： 为了尽可能多地成像神经突/鞘结构，应选择在x-y方向上相对平展的神经突区域。
    4. 放大至目标区域（通常生成像素尺寸为 0.14 - 0.30 µm 的图像）。
    5. 使用“区域”工具，在目标区域周围绘制一个矩形，并选择仅扫描选定区域的选项。通过仅扫描选定区域，可缩短扫描时间，从而减少激光暴露。
       注意： 由于水平矩形区域所需的扫描线数量较少，其扫描速度将快于垂直矩形区域。若需扫描垂直矩形区域，可通过旋转工具将扫描视野旋转90度，以缩短扫描时间。
11. 调节激光功率和增益，以获得线粒体的良好视野。
    注意： 使用所需的最低激光功率。如果可能，应优先调高增益而非增加激光功率。过高的激光功率不仅可能导致细胞毒性，还会随时间推移漂白成像目标，从而在扫描过程中需要进一步提高激光功率或增益。所需的激光功率和增益取决于荧光蛋白表达水平及显微镜型号。在 LSM700 共聚焦显微镜上，我们使用 555 nm 激光（功率 20–40 µW）成像 dsred 或 tdtomato，使用 488 nm 激光（功率 20–30 µW）成像 GFP（激光功率在物镜后孔径处测量）。活细胞成像时增益设置较高，GFP 通常为 700–800，dsred 和 tdtomato 通常为 850–980。较高的增益可能引入更多背景噪声，可通过提高数字偏移量来消除（偏移值通常在 0 至 15 之间）。根据我们的经验，MBP_mito_GFP 的信噪比优于 MBP_mito_dsred。
12. 选择扫描速度。
    注意： 通过使用快速扫描速度并划定较小的扫描区域（见下文第4.10.5点）来缩短扫描时间。也可通过执行双向扫描来节省扫描时间，但由于图像质量较差，不推荐此方法。
13. 设置延时成像的频率和持续时间，例如，对少突胶质细胞中的线粒体成像，每2秒采集一次图像，共持续20分钟。
    注意： 频率和持续时间应根据目标物体的运动性进行设置。较高的频率会使样品暴露于更多的激光照射下，但运动较快的物体也需要更短的延时成像总时长（例如，神经元中的线粒体比少突胶质细胞中的线粒体运动更频繁且速度更快，通常每秒成像一次，总时长为2分钟16）。
14. 开始延时录像。
    注意： 线粒体在记录过程中可能会移出焦平面和/或漂出成像区域。为尽量减少振动和移动，应调节灌流系统的进液口和出液口，并在需要时降低泵速。通常仍会出现轻微的焦距变化，因此在成像期间需持续监控屏幕，并在记录过程中对焦距进行微调。

采集整个细胞的z轴层扫图像（z-stack），用于后续对细胞及其成像过程的识别。
注意：为了获得更高的分辨率，z轴层扫图像采集时应将针孔重设为1个艾里单位（airy unit）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sigma	A9539
BD Microlance 19G	BD	301500	用于灌流槽进出液的针头
二氧化铋气体	AGA	105701
Brand 移液球	Sigma-Aldrich	Z615927	移液球
本生灯（液态丙烷燃烧器）	VWR	89038-530
加热控制器用电缆组件	Warner Instruments	64-0106	温度控制器—温度计部分
氯化钙	Fluka	21100
二氧化碳	AGA	100309	培养箱用 CO₂
盖玻片，方形 Corning	Thermo Fischer Scientific	13206778	用于固定在灌流槽下方进行活体成像。用胶水或凡士林密封。
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7021
精细镊子	Finescience	11063-07	用于解剖
金刚石刻划笔	Ted Pella Inc.	54463
一次性玻璃巴斯德吸管 230 mm	VWR	612-1702	玻璃移液管
双刃不锈钢剃刀刀片	Electron Microscopy Sciences	#7200	用于振动切片机的刀片
Earle's 平衡盐溶液 (EBSS)	Gibco-Invitrogen	24010-043
滤纸圆片	Schleicher & Schuell	3,00,220	用于 PFA 溶液过滤的滤纸
Fun tack	Loctite	1270884	用于连接/调节灌流槽中进出液口的位置
手巾 C 型折叠 2	Katrin	344388
Harp，适用于 RC-41 灌流槽	Warner Instruments	64-1418	用于固定灌流槽中的网格。在与组织切片共用时，使用前剪断悬挂线。1.5 mm, 13 mm, SHD-41/15
HEPES，分子量：260.3	Sigma	H-7006
Holten LaminAir，型号 1.2	Heto-Holten	96004000M	层流罩
马血清，热灭活	Gibco-Invitrogen	26050-088
KCl	Sigma	P9541
LCR 膜，PTFE	Millipore	FHLC0130	网格膜
Leica VT1200	Leica	14048142065	振动切片机
含 HEPES 的 MEM-Glutamax	Thermo Fischer Scientific	42360024
MgCl₂	R.P. Normapur	25 108.295
Micro Spoon Heyman B 型	Electron Microscopy Sciences	62411-B	小型圆头刮铲，末端锋利，用于解剖
Millex-GP 滤器单元	Millipore	SLGPM33RA	注射器滤器单元
Millicell 细胞培养插件，30 mm	Millipore	PICM03050	细胞培养插件
Minipuls 3 速度控制模块	GILSON	F155001	用于活体成像的蠕动泵—控制模块部分（需连接双通道泵头）
Na₂HPO₄	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S8282
NaHCO₃	Fluka	71628
Nunclon Delta 表面	Thermo Fischer Scientific	140675	培养板
制霉菌素混悬液	Sigma-Aldrich	N1638
物镜 W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC	Zeiss	441452-9900-000	用于活体成像的水浸物镜（工作距离=2.5 mm），可见光-红外光
Parafilm	VWR	291-1211
多聚甲醛，颗粒状	Electron Microscopy Sciences	#19208
PC-R 灌流室	SiSkiYou	15280000E	用于活体成像的灌流槽
青霉素-链霉素，液体	Invitrogen	15070-063
培养皿 140 mm	Heger	1075	大培养皿
培养皿 92x16 mm	Sarstedt	82.1473	中等培养皿
培养皿 55x14.2 mm	VWR	391-0868	小培养皿
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Sigma	P4417	PBS 片剂
R2 双通道泵头	GILSON	F117800	用于活体成像的蠕动泵—双通道泵头部分（需配合控制模块使用）
圆形/扁平不锈钢刮铲	VWR	82027-528	用于解剖的大刮铲
砂纸	VWR	MMMA63119	可选，用于打磨断裂的玻璃移液管
剪刀，17.5 cm	Finescience	14130-17	用于解剖的大剪刀
剪刀，8.5 cm	Finescience	14084-08	用于解剖的小型锋利剪刀
单刃宝石刀片	Electron Microscopy Sciences	#71972	单刃剃刀刀片
单通道 inline 溶液加热器 SH-27B	Warner Instruments	64-0102	温度控制器—加热部分
Steritop-GP 滤器单元，500 ml，45 mm	Millipore	SCGPT05RE	用于溶液灭菌的滤器
精密瞬间胶	Loctite	1577386
外科手术刀片，22号	Swann Morton Ltd.	209	圆头手术刀片
温度控制器 TC324B	Warner Instruments	64-0100	用于活体成像的温度控制器（需配合溶液加热器和电缆组件使用）
Trizma 碱	Sigma	T1503
Trizma 盐酸盐	Sigma	T3253
水套式培养箱 II 系列	Forma Scientific	78653-2882	培养箱