双光子显微镜用于研究小胶质细胞突起在小鼠脑切片中向化合物的趋化性

摘要

来源：Etienne, F. et al. 急性脑切片中通过双光子成像观察小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化性。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用双光子显微镜研究小胶质细胞突起向脑切片中注射的化合物趋化性迁移的方法。内容涵盖了小鼠脑切片的制备、趋化因子测试化合物的注射，以及对荧光标记的小胶质细胞进行成像以观察其反应的全过程。

方案

所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

结果

图1：界面室组件细节。 （A）切片支架的3D打印示意图。支架的外径为7 cm。（B）带有尼龙网的界面切片支架（箭头所示），可使研究人员将切片保持在液-气界面。（C）界面室装置，可在成像前维持切片处于加湿且通有碳酰气的环境（箭头指示用于鼓泡的管路）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于切片成像
× 25 0.95 NA 水浸物镜	Leica Microsystems (德国)	HCX Irapo
配备共振扫描器（8 kHz）和两个 HyD 混合探测器的双光子 MP5 直立显微镜	Leica Microsystems (德国)
Antlia-3C 数字蠕动泵	DD Biolab	178961	用于双光子成像室中 aCSF 的灌流
含 5% 二氧化碳和 95% 氧气的碳酰气（Carbogen）	Air Liquide France Industrie	I1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 钛蓝宝石激光器	Coherent (德国)
一次性移液管，宽口	ThermoFischer Scientific	例如：232-11	5.8 ml，带鳍状尖端，但需将其截短（约 7 cm），使管口直径为 4 mm
发射滤光片 SP680	Leica Microsystems (德国)
含 525/50 发射滤光片和 560 二向色滤光片的荧光立方体（用于荧光采集）	Leica Microsystems (德国)
含 50 mL ACSF 的玻璃烧杯，用于维持切片的持续灌流
加热系统	Warner Instrument Corporation	自动加热控制器 TC-324B	用于维持灌流液温度在 32°C
灌流室			自制，3D 打印文件见补充材料
切片固定器（“竖琴”）			自制：由铂金制成的发夹，两支通过平行的尼龙线连接
用于切片刺激
腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物（ATP）	Sigma	A-26209	需现配现用：实验当天配制 1 mg/ml（3 mM）的储备液，4°C 保存数小时，使用前稀释
荧光素（可选）	Sigma	F-6377	终浓度使用 1 µM
显微操作器	Luigs and Neumann	SM7	连接至微移液管固定器
微移液管固定器			与电生理实验所用相同
盐酸血清素	Sigma	H-9523	50 mM 储备液分装后溶于 H₂O，-20°C 保存。实验当天配制 500 µM 溶液。
5 mL 注射器（无针头）	Terumo 医疗产品	SS+05S1
透明管路	Fischer Scientific	11750105	Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 无 DEHP 管路
用于图像分析
Fiji		https://fiji.sc
Icy	Institut Pasteur	http://icy.bioimageanalysis.org
小鼠
CX3CR1-GFP 小鼠	Jung 等，2000		雄性或雌性，P3 至 2 月龄；已将这些小鼠回交至 129sv 背景。
CX3CR1creER-YFP 小鼠	Parkhurst 等，2013		雄性或雌性，P3 至 2 月龄；已将这些小鼠回交至 129sv 背景。