双光子显微镜，用于研究小鼠脑切片中化合物的小胶质细胞过程吸引力

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1.双光子显微镜

1. 参数设置
   1. 打开多光子系统（混合探测器、激光器、扫描仪、电光调制器、显微镜）。
   2. 注意：注意：即，不是荧光较暗的最深的 z 切片]），或降低扫描仪的速度。也可以通过将 z 步长增加到 3 μm 来降低轴向分辨率，但由于这可能会影响定量，因此所有要比较的实验都应使用相同的 z 步长进行。
      注意：^GFP/+切片和玻璃微量移液器的定位，以及化合物的局部应用
      1. 开始录制前 30 分钟将蠕动泵连接到录制室。用 50 mL 超纯水清洁整个灌注系统后，在恒定的碳化作用下，用玻璃烧杯中包含的 aCSF （50 mL） 开始灌注记录室。在整个实验过程中，使用在线微加热器或 Peltier 加热器将循环 aCSF 保持在 32 °C。
         注意：图 1A，B注意：注意：注意：^-1图 2B）。
      2. 注意：。，在最后一个比在第一个要成像的脑切片中更明显）。因此，前 ~30 μm 中的 z 平面不应用于分析，甚至可以跳过用于采集。
      3. 注意：2.小胶质细胞过程的吸引力分析
         1. 2D 投影和漂移校正
            1. 打开文件（.LIF） 与斐济。
            2. Image/Stacks/Tools/Make SubstackZ project 函数 （Image/Stacks/Z Project"） 并选择 最大强度MultiStackReg插件 （Plugin/Registration/MultiStackReg），选择 作 1： align 和 变换：Rigid Body数据处理
               1. 使用 Icy 打开这个新文件。
               2. R1ROI强度演变结果的量化和表示
                  1. 要量化小胶质细胞随时间的变化反应，请确定每个时间点。
                     然后，结果可以表示为小胶质细胞反应的动力学，或在特定时间点（参见 图 3）。

图 1：界面室细节。（A） 切片架的 3D 打印轮廓。支架的外径为 7 cm。（B） 带有尼龙网（箭头）的接口切片支架，允许研究人员将切片保持在液-气界面。（C） 接口室装置，可以在切片成像之前将其保持在碳化（箭头表示用于鼓泡的管道）和加湿环境中。

图 2：灌注室细节。（A） 3D 打印的轮廓。灌注室的外径为 5.9 cm。（B） 带有尼龙网（箭头）的灌注室，用于支撑切片，防止其接触下面的载玻片，并允许 aCSF 在其上方和下方流动。（C） 双光子显微镜下组件的照片。将化合物本地输送的微量移液器在右侧可见（星号）。（D） 移液器在明场中成像。比例尺 = 60 μm。

图 3：微量移液器在切片中的位置。使用充满荧光素 （1 μM） 的微量移液器采集一堆图像（在 30 日龄动物的海马体中）的示例。荧光素可以在沿 （A） z 轴或 （B） y 轴的最大投影中定位移液器（星号）。请注意，在图 B 中，虽然荧光较暗，但移液器吸头下方也有小胶质细胞。在这个图示的示例中，整个堆栈（包括在切片的最浅层部分拍摄的图像）已用于投影。比例尺 = 30 μm 在图 A 中，如图 B 中所示（每个刻度 = 50 μm）。堆栈的 z 厚度 = 220 μm。

图 4：次优实验示例。这些切片在成像前等待了 6 个多小时，并且从它们的上表面开始就进行了成像。（A） 具有大量碎片（大致为圆形荧光颗粒，但边界不规则;星号）和"浓密"小胶质细胞（箭头）的 z 堆栈示例，即具有众多但较短的过程。请注意扩大的工艺末端（箭头），它们看起来像轴突生长锥。堆栈的 z 厚度 = 220 μm。其他两个面板显示了同一切片的两个子堆栈，其中 （B） 1-30 个 z 平面（z 厚度 = 59 μm）和 （C） 30-120 个 z 平面（z 厚度 = 180 μm）。在顶部平面（如图 B 所示）上，除了图 A 中所示的大型工艺端子和碎屑外，还有具有不寻常的大扁平体或突起（星形）的小胶质细胞。在较深的平面上（如图 C 所示），没有碎片或扁平物体，但细胞是浓密的（箭头），密度异常高。总而言之，这些观察结果表明小胶质细胞并不处于正常状态。