双光子显微镜用于研究小胶质细胞突起在小鼠脑切片中向化合物的趋化性

摘要

来源：Etienne, F. et al. 急性脑切片中通过双光子成像观察小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化性。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用双光子显微镜研究小胶质细胞突起向脑切片中注射的化合物趋化性迁移的方法。内容涵盖了小鼠脑切片的制备、趋化因子测试化合物的注射，以及对荧光标记的小胶质细胞进行成像以观察其反应的全过程。

方案

所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 双光子显微镜

1. 参数设置
   1. 打开多光子系统（混合探测器、激光器、扫描器、电光调制器、显微镜）。
   2. 将激光器调谐至920 nm，检查激光器是否处于锁模状态，并将功率设置为5%–15%，增益设置为10%。这相当于物镜下的功率为3–5 mW。确保非扫描探测器已启用，并安装了适当的发射和激发滤光片。
   3. 将成像软件的参数设置如下：帧尺寸为1024 × 1024像素，对应面积为295.07 × 295.07 µm；放大倍数为2。若信号噪声较大，应用2次行平均。对于像素动态范围，将成像软件设置为12位或更高。
      注意： 较高位深的图像比低位深图像能更清晰地区分荧光强度的微小差异：在8位图像中1个灰度值的变化，相当于12位图像中的16个灰度值变化，以及16位图像中的256个灰度值变化。因此，高位深图像更适合定量分析；但由于图像文件大小随位深增加而增大，存储空间和计算能力可能成为限制因素。
   4. 选择扫描模式XYZT，Z轴间隔范围为2 µm，T轴间隔为2 min。
      注意： x、y 和 z 方向的分辨率由奈奎斯特采样定理确定。Z 轴步长约为 0.8 时，最适合分辨小胶质细胞突起（直径为 <1 µm），但多光子显微镜的光学分辨率存在限制（在920 nm波长下使用0.95 NA物镜时，轴向分辨率约为1 µm）。除了这一物理限制外，在活体成像实验中，灵敏度或信噪比、分辨率、成像速度以及总观察时间同样重要。综合考虑上述各项参数，本实验选择2 µm的z轴步进、1024 × 1024像素的图像尺寸，并采用共振扫描器结合HyD探测器进行高速图像采集（采集50层z轴图像约需15秒）。图像采集频率为每2分钟获取一次XYZT序列，总持续时间为30分钟。若设备速度或灵敏度不足，可降低横向分辨率（降至512 × 512）或减少z轴切片数量（仅对荧光信号最强的z轴深度进行成像）即， 而非荧光较弱的最深层z平面]，或降低扫描速度。也可通过增大z步进至3 µm来降低轴向分辨率，但由于这可能影响定量结果，所有需相互比较的实验应采用相同的z步进设置。
      注意： 可在CX3CR1creER-YFP小鼠的脑片上进行类似的实验，该小鼠品系可用于特异性诱导小胶质细胞中的基因敲除，且其小胶质细胞组成性表达黄色荧光蛋白（YFP）。然而，与CX3CR1小鼠中绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平相比，YFP的表达水平非常低。^GFP/+ 小鼠；因此，成像可行但具有挑战性，需要优化采集参数。建议按如下方式调整。
   5. 将激光器调至 970 nm（相较于 920 nm 更适合 YFP 的激发），功率设为 50%，增益设为 50%，此时物镜下的激光功率为 5 - 6 mW。
   6. 将线平均值设为4（或更高）以提高信噪比。
2. 切片与玻璃微电极的定位，以及化合物的局部施加
   1. 在开始记录前30分钟，将蠕动泵连接至记录室。用50 mL超纯水清洗整个灌流系统后，开始向记录室灌流盛于玻璃烧杯中的aCSF（50 mL），并持续通入碳氧混合气（carbogen）。实验过程中，使用管路式微型加热器或帕尔贴加热器将循环的aCSF温度维持在32 °C。
      注意： 设计了一种具有顶部和底部灌流的特制灌流室，以优化脑片两侧的氧合。该灌流室由两个完全匹配的部件组成，其间夹有一层拉伸的聚酰胺网膜（图1A,B与其它类型的腔室相比，该腔室可减少脑片底部神经元的死亡，提高脑片存活率，并减轻因脑片肿胀引起的移动。在其它类型的腔室中，脑片直接放置在玻璃盖玻片上。
   2. 使用宽口一次性移液管将待成像的脑片转移至aCSF烧杯中，以去除滤纸，待其自然下沉（以此确认无气泡附着），再将其转移至记录（灌流） chamber。
   3. 将切片固定器（由铂金制成的发夹状结构，两端通过平行的尼龙丝连接）放置在切片上，以尽量减少灌流液流动引起的切片移动。
   4. 使用明场照明，结合低倍物镜（5X 或 10X），定位目标脑区（曝光时间：50 至 80 ms）。切换至高倍水浸物镜（25X 配合 0.35X 镜头），并调整位置。
      注意： 避免对靠近切片夹持器尼龙线的区域进行成像，因为这些尼龙线可能阻挡光线并对切片局部造成形变。确保目标区域平整。如有必要，可取出切片夹持器以重新调整切片和/或夹持器的位置。
   5. 使用荧光照明在视野中定位待成像的荧光小胶质细胞（曝光时间：250 - 500 ms）。
      注意： 此步骤可使研究人员检测目标区域中细胞的存在情况及其荧光强度，并控制细胞碎片的数量。
   6. 用含ATP、5-HT或目标药物（终浓度）的aCSF回填移液器，体积为10 µL。将移液器尖端朝下，轻轻晃动，以去除尖端内残留的气泡。
      注意： 如果待注射溶液容易产生气泡，可考虑使用带内部细丝的硼硅酸盐移液管。三磷酸腺苷（ATP）从移液管中泄漏可能会在注射前吸引小胶质细胞突起（若发生此情况，在分析步骤中可见）。尽管在所用ATP浓度（500 µmol·L⁻¹）下该现象应较为轻微，^-1），如果存在问题，可在步骤 1.2.6 添加 ATP（或其他化合物）溶液之前，先用 2 mL aCSF 预填充微量移液器。
   7. 将装好溶液的移液管安装在移液管架上，通过透明软管连接至一支5 mL注射器，注射器推杆置于5 mL刻度位置。移液管架本身固定在三轴显微操作器上。
   8. 在明场照明下，使用显微操作仪将移液管置于视野中央。为实现可重复且最佳的居中效果，应显示并利用图像上的标尺进行定位。
   9. 轻轻将移液管向切片下降，同时控制并调整物镜位置，直至移液管尖端轻微接触切片表面。一旦观察到移液管接触切片即停止下降，可使移液管尖端穿透切片表面80 - 100 µm（参见 图2B).
   10. 调节激光器（参见上述参数），并将显微镜切换至多光子模式。确保成像腔室屏蔽所有光源（例如计算机屏幕发出的光）。开启非扫描探测器并设置增益。使用带有颜色编码上限的查找表（LUT），以避免图像像素饱和。
   11. 确定待成像切片的厚度（即荧光可检测到的上下 z 轴位置，通常总厚度在 220 至 290 µm 之间）。
       注意： 与脑片内部相比，在脑片表面，突起的密度增加，小胶质细胞的密度也可能增加，且常具有不寻常的形态。这种聚集现象会随着时间的推移而更加明显（即.，这在最后一层脑切片中比在第一层中更明显。因此，前约30 µm的z平面不应用于分析，甚至可在采集时跳过。
   12. 开始记录，总时长为30分钟（或根据需要更长时间），在5分钟基线期后，局部施加待测化合物（无需中断成像过程）。操作时，缓慢推动连接至微移液管的注射器活塞，从5 mL位置推至1 mL位置（约耗时5秒）。按压活塞时应立即感受到阻力，若无阻力，则提示尖端可能已损坏。
       注意： 对于有经验的操作者，采用该方法进行注射具有可重复性，但除手动操作移液器外，也可将移液器连接至自动压力喷射系统，以更精确地控制注射体积。注射会在脑片注射部位造成物理性形变。这种形变在注射后最初两到三张图像中可见，但在第四张图像（即注射后8分钟）中应已不可见。若形变持续存在，请考虑调整移液器制备的相关参数。
   13. 采集结束（30 分钟）后，弃去微量移液管并取出脑片。
   14. 在开始对新切片进行成像之前，先制作二维视频（第2.1节），以检查小胶质细胞是否具有正常形态并处于运动状态，从而确认切片处于健康状态。

2. 小胶质细胞突起趋化性的分析

1. 二维投影与漂移校正
   1. 使用 Fiji 打开文件（.LIF）。
   2. 如有必要，仅使用感兴趣的 z 平面创建子堆栈（Image/Stacks/Tools/Make Substack）。例如，若采集了但不用于分析的切片表面所对应的 z 平面（参见步骤 1.2.11 后的注释）以及无荧光信号的最深 z 平面，应予以排除。最终堆栈通常包含 90–110 个 z 切片（180–220 µm）。
   3. 启动 Z 投影 功能（Image/Stacks/Z Project），选择 最大强度 投影类型，对每个时间点采集的 z 堆栈进行投影。
   4. 启动 MultiStackReg 插件（Plugin/Registration/MultiStackReg），选择 操作 1：对齐 和 变换：刚体，以校正在采集过程中可能出现的轻微漂移。将此 2D 视频另存为新文件（.tiff）。
2. 数据处理
   1. 使用 Icy 打开此新文件。
   2. 在注射位点（可通过移液管的阴影及注射时造成的组织形变识别）中心绘制一个直径为 35 µm 的圆形 R1 �感兴区域（ROI）。
   3. 使用插件 ROI 强度演化，测量 R1 区域随时间变化的平均强度。
   4. 将结果保存为 .XLS 文件。
3. 结果的量化与呈现
   1. 为量化小胶质细胞随时间的反应，需在每个时间点进行测定。
      随后，可将结果表示为小胶质细胞反应的动力学曲线，或在特定时间点进行展示（见 图 3）。

结果

图1：界面室组件细节。 （A）切片支架的3D打印示意图。支架的外径为7 cm。（B）带有尼龙网的界面切片支架（箭头所示），可使研究人员将切片保持在液-气界面。（C）界面室装置，可在成像前维持切片处于加湿且通有碳酰气的环境（箭头指示用于鼓泡的管路）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于切片成像
× 25 0.95 NA 水浸物镜	Leica Microsystems (德国)	HCX Irapo
配备共振扫描器（8 kHz）和两个 HyD 混合探测器的双光子 MP5 直立显微镜	Leica Microsystems (德国)
Antlia-3C 数字蠕动泵	DD Biolab	178961	用于双光子成像室中 aCSF 的灌流
含 5% 二氧化碳和 95% 氧气的碳酰气（Carbogen）	Air Liquide France Industrie	I1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 钛蓝宝石激光器	Coherent (德国)
一次性移液管，宽口	ThermoFischer Scientific	例如：232-11	5.8 ml，带鳍状尖端，但需将其截短（约 7 cm），使管口直径为 4 mm
发射滤光片 SP680	Leica Microsystems (德国)
含 525/50 发射滤光片和 560 二向色滤光片的荧光立方体（用于荧光采集）	Leica Microsystems (德国)
含 50 mL ACSF 的玻璃烧杯，用于维持切片的持续灌流
加热系统	Warner Instrument Corporation	自动加热控制器 TC-324B	用于维持灌流液温度在 32°C
灌流室			自制，3D 打印文件见补充材料
切片固定器（“竖琴”）			自制：由铂金制成的发夹，两支通过平行的尼龙线连接
用于切片刺激
腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物（ATP）	Sigma	A-26209	需现配现用：实验当天配制 1 mg/ml（3 mM）的储备液，4°C 保存数小时，使用前稀释
荧光素（可选）	Sigma	F-6377	终浓度使用 1 µM
显微操作器	Luigs and Neumann	SM7	连接至微移液管固定器
微移液管固定器			与电生理实验所用相同
盐酸血清素	Sigma	H-9523	50 mM 储备液分装后溶于 H₂O，-20°C 保存。实验当天配制 500 µM 溶液。
5 mL 注射器（无针头）	Terumo 医疗产品	SS+05S1
透明管路	Fischer Scientific	11750105	Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 无 DEHP 管路
用于图像分析
Fiji		https://fiji.sc
Icy	Institut Pasteur	http://icy.bioimageanalysis.org
小鼠
CX3CR1-GFP 小鼠	Jung 等，2000		雄性或雌性，P3 至 2 月龄；已将这些小鼠回交至 129sv 背景。
CX3CR1creER-YFP 小鼠	Parkhurst 等，2013		雄性或雌性，P3 至 2 月龄；已将这些小鼠回交至 129sv 背景。