双光子显微镜，用于研究小鼠脑切片中化合物的小胶质细胞过程吸引力

Abstract

来源：Etienne， F. et al. 急性脑切片中小胶质细胞过程对 ATP 或血清素的吸引力的双光子成像。J. Vis. Exp. （2019）

本视频演示了使用双光子显微镜研究小胶质细胞过程对脑切片中注射化合物的吸引力。它概述了如何制备小鼠脑切片、注射化学引诱测试化合物以及对荧光标记的小胶质细胞进行成像以可视化它们的反应。

Protocol

<元字符集='utf-8'>

<元字符集='utf-8'>

1.双光子显微镜

1. 参数设置
   1. 打开多光子系统（混合探测器、激光器、扫描仪、电光调制器、显微镜）。
   2. 注意：注意：即，不是荧光较暗的最深的 z 切片]），或降低扫描仪的速度。也可以通过将 z 步长增加到 3 μm 来降低轴向分辨率，但由于这可能会影响定量，因此所有要比较的实验都应使用相同的 z 步长进行。
      注意：^GFP/+切片和玻璃微量移液器的定位，以及化合物的局部应用
      1. 开始录制前 30 分钟将蠕动泵连接到录制室。用 50 mL 超纯水清洁整个灌注系统后，在恒定的碳化作用下，用玻璃烧杯中包含的 aCSF （50 mL） 开始灌注记录室。在整个实验过程中，使用在线微加热器或 Peltier 加热器将循环 aCSF 保持在 32 °C。
         注意：图 1A，B注意：注意：注意：^-1图 2B）。
      2. 注意：。，在最后一个比在第一个要成像的脑切片中更明显）。因此，前 ~30 μm 中的 z 平面不应用于分析，甚至可以跳过用于采集。
      3. 注意：2.小胶质细胞过程的吸引力分析
         1. 2D 投影和漂移校正
            1. 打开文件（.LIF） 与斐济。
            2. Image/Stacks/Tools/Make SubstackZ project 函数 （Image/Stacks/Z Project"） 并选择 最大强度MultiStackReg插件 （Plugin/Registration/MultiStackReg），选择 作 1： align 和 变换：Rigid Body数据处理
               1. 使用 Icy 打开这个新文件。
               2. R1ROI强度演变结果的量化和表示
                  1. 要量化小胶质细胞随时间的变化反应，请确定每个时间点。
                     然后，结果可以表示为小胶质细胞反应的动力学，或在特定时间点（参见 图 3）。

Results

图 1：界面室细节。（A） 切片架的 3D 打印轮廓。支架的外径为 7 cm。（B） 带有尼龙网（箭头）的接口切片支架，允许研究人员将切片保持在液-气界面。（C） 接口室装置，可以在切片成像之前将其保持在碳化（箭头表示用于鼓泡的管道）和加湿环境中。

Materials