使用 Golgi-Cox 金属染色对小鼠脑切片中的神经元进行显微成像

摘要

资料来源：Louth， E. L.， et al。使用 Golgi-Cox 方法对厚脑切片内的神经元进行成像。J. Vis. Exp. （2017）

该视频通过设置上下焦点边界和捕获重叠图像，演示了在高尔基-考克斯染色的厚脑切片中对神经元进行成像。对多个位置进行成像以确保详细的神经元投影，这些投影组合在一起以创建 3D 表示。

方案

所有涉及动物样本的程序都已由相应的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 高尔基-考克斯染色

1. 高尔基-考克斯浸渍大脑
   1. 通过溶解重铬酸钾制成 1% （w/v） 重铬酸钾、0.8% （w/v） 铬酸钾和 1% （w/v） 氯化汞的高尔基-Cox 溶液和铬酸钾分别在优质水中。混合溶液，加入氯化汞，并使用 1 级滤纸过滤最终溶液。将溶液在黑暗中存放长达一个月。
   2. 使用 5% 异氟醚麻醉鼠标。
   3. 通过斩首对老鼠实施安乐死，并迅速取出大脑。
   4. 将大脑放入含有 17 mL 高尔基体-Cox 溶液的 20 mL 玻璃闪烁瓶中，并在室温下避光孵育 25 天。
   5. 将大脑放入含有 40 mL 蔗糖冷冻保护剂（30% （w/v） 蔗糖在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中，pH 7.4）在 4 °C 避光 24 小时，从而对大脑进行冷冻保护。
      注意：以下可选的三个步骤可以作为主协议的替代方案，以便在此阶段冻结大脑以进行长期存储。
   6. 将整个大脑浸入 200 mL 干冰预冷的异戊烷中，冷冻整个大脑。
   7. 将冷冻的大脑放入 50 mL 锥形管中，并在 -80 °C 的黑暗中储存。
   8. 当准备好进行时，将其放入含有 40 mL 蔗糖冷冻保护剂的 50 mL 锥形管中，并在 4 °C 的黑暗中保持 24 小时，以解冻大脑。
2. Brain Sectioning
   1. 从蔗糖中取出大脑，用剃须刀片切掉小脑，并在大脑剩余的尾端留下一个平坦的边缘，以阻止它进行切片。
   2. 加热琼脂（3% （w/v） 水溶液）直到它融化，然后让它冷却直到略高于其熔点。
   3. 将大脑放入一个一次性小的称重皿中，尾端朝下，加入足量的融化琼脂以覆盖它。
   4. 琼脂凝固后，修剪多余的琼脂，在大脑周围留下大约 2 - 4 毫米的距离，并使用少量氰基丙烯酸乙酯胶将大脑粘在振动切片机的舞台上，其尾端面朝下。
   5. 用足量的蔗糖冷冻保护剂填充振动切片机的舞台区域以覆盖大脑，并使用 400 Hz 的振动频率和 0.125 mm/s 的刀片推进速度，以 500 - 500 μm 的切片厚度（取决于要检查的大脑区域）切片。
   6. 使用小画笔，将脑切片放入 6 孔组织培养板的孔中，该板包含市售的网底插件，并预填充了 10 mL 6% （w/v） 蔗糖，溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。
   7. 在 4 °C O / N 的黑暗中孵育切片。
3. 显影脑切片
   1. 使用网底插件将脑切片转移到含有 5 mL 2% （w/v） 多聚甲醛 （PBD） 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）的新孔中。在摇杆上孵育，在 RT 下在黑暗中缓慢移动 15 分钟。
   2. 切片应转移到装有 5 mL 水的新井中，洗涤两次。它们应该在摇杆上在 RT 下在黑暗中以中等速度移动 5 分钟。
   3. 将切片转移到含有 5 mL 2.7% （v/v） 氢氧化铵的新孔中。在摇杆上孵育，在 RT 下在黑暗中缓慢移动 15 分钟。
   4. 切片应转移到装有 5 mL 水的新井中，洗涤两次。它们应该在摇杆上在 RT 下在黑暗中以中等速度移动 5 分钟。
   5. 将切片转移到一个新孔中，该孔中含有 5 mL 固定剂 A，在水中稀释了 10 倍于其原始购买浓度的 10 倍。在摇杆上孵育，在 RT 下在黑暗中缓慢移动 25 分钟。
   6. 切片应转移到装有 5 mL 水的新井中，洗涤两次。它们应该在摇杆上在 RT 下在黑暗中以中等速度移动 5 分钟。
4. 安装大脑切片
   1. 使用小画笔，将切片安装到显微镜载玻片上。使用镊子和小纸巾，去除多余的水和琼脂。确保在进行脱水之前去除所有琼脂。
   2. 让切片在 RT 下风干约 45 分钟（400 μm 切片）或 90 分钟（500 μm 切片）。
      注意：干燥的时间和适当的干燥程度至关重要，可能需要根据环境温度和湿度在每个实验室中确定。干燥时间太短会导致切片在随后的脱水步骤中从载玻片上脱落，而干燥时间过长会导致切片开裂。在适当的干燥程度下，切片仍然会显得有光泽。
   3. 如图所示，将载玻片放入 Coplin 染色罐中，用甲酚紫染色切片。
      注意：此可选步骤可用于从未冷冻过的切片，以用甲酚紫对神经元核进行染色。我们发现，在甲酚紫中孵育之前清除和再水化切片会导致切片染色均匀且背景低。
      1. 放入清算代理中 5 分钟。重复一次。
      2. 置于 100% 乙醇中 5 分钟。重复一次。
      3. 将 95% 乙醇放入水中，然后将 75% 乙醇放入水中，再将 50% 乙醇放入水中，各放置 2 分钟。
      4. 放入水中 5 分钟。
      5. 置于 0.5% （w/v） 甲酚紫中水中 7 分钟。
      6. 放入水中 2 分钟。重复一次。
   4. 脱水切片。
      1. 置于 50% 乙醇的水溶液中，然后放入 75% 乙醇的水溶液中，然后放入 95% 乙醇的水溶液中，各 2 分钟。
      2. 置于 100% 乙醇中 5 分钟。重复一次。
      3. 置于清除剂中 5 分钟。重复一次。
         注意：这些脱水和清除时间足以处理本手稿中描述的小鼠大脑。然而，我们观察到，对于其他物种，包括大鼠和牛鸟，最后的清除步骤可能需要总共延长至 15 分钟。
   5. 使用无水封固剂的盖玻片切片。
   6. 让玻片在 RT 下在黑暗中水平干燥至少 5 天。

2. 对厚脑切片

1. 内染色的神经元进行成像Capturing Image Stacks
   1. 打开显微镜灯泡、相机和载物台控制器。
   2. 打开显微镜软件（例如，Neurolucida）。
   3. 将载玻片放在显微镜载物台上。
   4. 使用低放大倍率物镜（如 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO 或 4X 0.16 N.A.）捕获大脑切片的 2D 广角图像。
      1. 专注于图像并调整相机设置，包括曝光时间和白平衡。
      2. 通过在 section
      3. 通过在图像采集窗口中选择"获取单个图像"来捕获图像，从而创建参考点。
   5. 使用 10X 0.3 N.A. UPlan FL N 物镜捕获包含感兴趣神经元的区域的中分辨率图像堆栈。
      1. 专注于图像并调整相机设置，包括曝光和白平衡。
      2. 设置图像堆栈的上限和下限，方法是将焦点聚焦到该部分的顶部，并在图像采集窗口中选择"堆栈顶部"旁边的"设置"，然后聚焦到该部分的底部，并在图像采集窗口中选择"堆栈底部"旁边的"设置"。
      3. 通过在图像采集窗口中的"距离"旁边输入 "5 μm" 将步距设置为 5 μm。
      4. 堆栈。
      5. 重复上述步骤以捕获整个感兴趣区域，确保所有图像堆栈在 X 轴和 Y 轴上至少重叠 10%。
   6. 使用 30X 1.05 N.A. 硅油浸物镜捕获包含感兴趣神经元的区域的高分辨率图像堆栈。
      1. 在载玻片上滴 3 - 4 滴硅油，然后将物镜放在载玻片上，确保物镜与油接触。
      2. 专注于图像并调整相机设置，包括曝光度和白平衡。
      3. 设置图像堆栈的上限和下限，方法是将焦点聚焦到该部分的顶部，并在图像采集窗口中选择"堆栈顶部"旁边的"设置"，然后聚焦到该部分的底部，并在图像采集窗口中选择"堆栈底部"旁边的"设置"。
      4. 通过在图像采集窗口中的"distance between images"旁边输入 "1 μm" 将步距设置为 1 μm。
      5. 堆栈。
      6. 重复上述步骤以捕获整个感兴趣区域，确保所有图像堆栈在 X 轴和 Y 轴上至少重叠 10%。
   7. 以 TIFF 格式保存数据文件和所有图像文件以供外部处理。
2. 创建 Z 投影图像和图像蒙太奇
   1. 在 ImageJ 中创建 Z 投影图像< style='list-style-type：decimal;'>
   2. 打开安装了 Bio-Formats 插件的 ImageJ 软件。
   3. 选择"插件"->"生物格式"->"生物格式导入器"。
   4. 选择要打开的图片堆栈文件。
   5. 打开文件后，通过选择"Image" -> "Type" -> "RGB Color" 将格式更改为 RGB。
   6. 通过选择 "Image" -> "Stacks" -> "Z Project..." 来创建 Z 投影。
   7. 将二维 Z 投影图像另存为 TIFF 文件。
3. 创建整个感兴趣区域的二维图像蒙太奇。
   1. 打开软件（例如，Adobe Photoshop）。
   2. 选择"文件"->"自动"->"Photomerge"。
   3. 选择"浏览"，然后添加所有要合并的图像文件。
   4. 确保选中"混合图像"，然后选择"确定"。
   5. 将整个感兴趣区域的蒙太奇图像保存为 TIFF 文件。

材料