使用高尔基-考克斯金属染色法对小鼠脑切片中神经元进行显微成像

摘要

来源：Louth, E. L.，等。使用 Golgi-Cox 方法对厚脑切片中的神经元进行成像。J. Vis. Exp. (2017)

本视频通过设定焦平面的上下边界并采集重叠图像，展示了高尔基-考克斯染色的厚脑切片中神经元的成像过程。对多个位置进行成像以确保神经元投射的细节完整，并将这些图像合并以构建三维表征。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 高尔基-考克斯染色

1. 脑组织的高尔基-考克斯浸渍法
   1. 配制高尔基-考克斯溶液：将1%（w/v）重铬酸钾和0.8%（w/v）铬酸钾分别溶于高质量水中，混合后加入1%（w/v）氯化汞，用1号滤纸过滤最终溶液。避光保存，最多可使用一个月。
   2. 使用5%异氟烷麻醉小鼠。
   3. 通过断头法处死小鼠，并迅速取出脑组织。
   4. 将脑组织放入含有17 mL高尔基-考克斯溶液的20 mL玻璃闪烁瓶中，避光、室温下孵育25天。
   5. 将脑组织转移至含有40 mL蔗糖冷冻保护剂（30%（w/v）蔗糖溶于0.1 M磷酸缓冲液，pH 7.4）的50 mL锥形管中，避光、4 °C条件下孵育24小时，进行冷冻保护。
      注意：以下三个可选步骤可用于替代主方案，以便在此阶段将脑组织冷冻以实现长期保存。
   6. 将脑组织浸入经干冰预冷的200 mL异戊烷中，进行整体冷冻。
   7. 将冷冻后的脑组织放入50 mL锥形管中，避光、-80 °C条件下保存。
   8. 准备继续实验时，将脑组织放入含有40 mL蔗糖冷冻保护剂的50 mL锥形管中，避光、4 °C条件下孵育24小时以解冻。
2. 脑组织切片
   1. 从蔗糖溶液中取出脑组织，用刀片切除小脑部分，使剩余脑组织尾端形成一个平整的切面，以便后续切片。
   2. 将琼脂（3%（w/v）水溶液）加热至完全融化，随后冷却至略高于其熔点的温度。
   3. 将脑组织尾端朝下放置于小型一次性称量皿中，加入足量熔化的琼脂以完全覆盖脑组织。
   4. 待琼脂凝固后，修剪多余琼脂，使脑组织周围保留约2–4 mm厚度，然后使用少量氰基丙烯酸乙酯胶水将脑组织尾端朝下粘附于振动切片机的载物台上。
   5. 向振动切片机的载物区域加入足量蔗糖冷冻保护剂以覆盖脑组织，设置振动频率为86 Hz、刀片推进速度为0.125 mm/s，切片厚度为400–500 µm（根据待观察脑区决定）。
   6. 使用小号画笔将脑切片转移至6孔细胞培养板的孔中，孔内已预先放置市售底部带网的插入式培养插件，并加入10 mL含6%（w/v）蔗糖的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）。
   7. 避光、4 °C条件下孵育过夜。
3. 脑切片显影
   1. 使用带网底的插入式插件，将脑切片转移至新孔中，孔内含5 mL 2%（w/v）多聚甲醛（PBD）溶于0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）。置于摇床上，缓慢振荡，避光、室温孵育15分钟。
   2. 将切片转移至含5 mL水的新孔中，洗涤两次。每次在摇床上以中等速度振荡，避光、室温洗涤5分钟。
   3. 将切片转移至含5 mL 2.7%（v/v）氨水的新孔中。置于摇床上，缓慢振荡，避光、室温孵育15分钟。
   4. 将切片转移至含5 mL水的新孔中，洗涤两次。每次在摇床上以中等速度振荡，避光、室温洗涤5分钟。
   5. 将切片转移至含5 mL Fixative A的新孔中，该溶液为原始购买浓度经水稀释10倍后的使用液。置于摇床上，缓慢振荡，避光、室温孵育25分钟。
   6. 将切片转移至含5 mL水的新孔中，洗涤两次。每次在摇床上以中等速度振荡，避光、室温洗涤5分钟。
4. 脑切片封片
   1. 使用小号画笔将切片转移至载玻片上。用镊子和小片纸巾去除多余的水分和琼脂。在进行脱水前，确保所有琼脂已被彻底清除。
   2. 室温下自然晾干，约45分钟（400 μm切片）或90分钟（500 μm切片）。
      注意：干燥时间和干燥程度至关重要，需根据实验室环境温度和湿度进行优化。干燥时间过短会导致切片在后续脱水过程中脱落，过长则会导致切片开裂。在适当干燥程度下，切片表面仍应呈现光泽。
   3. 将载玻片放入考马斯亮蓝染色缸中，使用焦油紫对切片进行染色。
      注意：此可选步骤适用于从未冷冻过的切片，用于焦油紫染色神经元细胞核。我们发现，在焦油紫染色前对切片进行透明和复水处理，可实现染色均匀且背景较低。
      1. 放入透明剂中5分钟，重复一次。
      2. 放入100%乙醇中5分钟，重复一次。
      3. 依次放入95%乙醇水溶液、75%乙醇水溶液和50%乙醇水溶液，每种溶液各2分钟。
      4. 放入水中5分钟。
      5. 放入0.5%（w/v）焦油紫水溶液中7分钟。
      6. 放入水中2分钟，重复一次。
   4. 将载玻片放入考马斯亮蓝染色缸中，对切片进行脱水处理。
      1. 依次放入50%乙醇水溶液、75%乙醇水溶液和95%乙醇水溶液，每种溶液各2分钟。
      2. 放入100%乙醇中5分钟，重复一次。
      3. 放入透明剂中5分钟，重复一次。
         注意：上述脱水和透明时间适用于本文所述的小鼠脑组织处理。然而，我们观察到对于其他物种（如大鼠和牛鹂），最终透明步骤可能需要延长至总共15分钟。
   5. 使用无水封片剂对切片进行盖片。
   6. 将载玻片水平放置，避光、室温下干燥至少5天。

2. 厚脑切片中染色神经元的成像

1. 捕获图像序列
   1. 打开显微镜灯泡、相机和载物台控制器。
   2. 打开显微镜软件（例如，Neurolucida）
   3. 将载玻片放置在显微镜载物台上。
   4. 使用低倍物镜（如 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO 或 4X 0.16 N.A.）拍摄脑切片的二维宽视野图像
      1. 聚焦图像，并调整相机设置，包括曝光时间和白平衡。
      2. 通过在切片任意位置左键单击创建参考点
      3. 在图像采集窗口中选择“采集单张图像”以获取图像。
   5. 使用10X 0.3 N.A. UPlan FL N物镜，对包含目标神经元的区域采集中等分辨率的图像序列。
      1. 聚焦图像，并调整相机设置，包括曝光和白平衡。
      2. 通过在图像采集窗口中将焦距调至样本区域顶部，点击“图像栈顶部”旁边的“设置”按钮，然后将焦距调至样本区域底部，点击“图像栈底部”旁边的“设置”按钮，以设定图像栈的上下边界。
      3. 在图像采集窗口中，“图像间距离”旁输入“5 μm”，将步进距离设置为5 μm。
      4. 在图像采集窗口中选择“采集图像堆栈”以获取图像序列。
      5. 重复上述步骤以覆盖整个目标区域，确保所有图像堆栈在X轴和Y轴方向上至少有10%的重叠。
   6. 使用30X 1.05 N.A. 硅油浸没式物镜，对包含目标神经元的区域采集高分辨率图像序列。
      1. 在载玻片上滴加3至4滴硅油浸油，将物镜置于载玻片上方，确保物镜与油滴接触。
      2. 聚焦图像并调整相机设置，包括曝光和白平衡。
      3. 在图像采集窗口中，先将焦距调至切片顶部，点击“图像栈顶部”旁的“设置”以设定图像栈的上边界；再将焦距调至切片底部，点击“图像栈底部”旁的“游戏副本”以设定图像栈的下边界。
      4. 在图像采集窗口中，“图像间距离”旁输入“1 μm”，将步进距离设为1 μm。
      5. 在图像采集窗口中选择“采集图像序列”以获取图像序列。
      6. 重复上述步骤以覆盖整个目标区域，确保所有图像堆栈在X轴和Y轴方向上至少重叠10%。
   7. 将数据文件和所有图像文件以TIFF格式保存，用于外部处理。
2. 创建Z轴投影图像与图像拼接图
   1. 在 ImageJ 中创建 Z 投影图像
      1. 打开已安装 Bio-Formats 插件的 ImageJ 软件。
      2. 选择“插件” -> “Bio-Formats”> Bio-Formats 导入器
      3. 选择要打开的图像堆栈文件。
      4. 文件打开后，通过选择“Image”（图像）→“Mode”（模式）→“RGB Color”（RGB 颜色）将格式更改为 RGB。> 类型 -> RGB颜色
      5. 通过选择“Image”创建Z轴投影> “堆叠”> “Z项目…”
      6. 将二维Z轴投影图像保存为TIFF文件。
   2. 创建感兴趣区域的完整二维图像拼接图。
      1. 打开软件（例如，Adobe Photoshop）。
      2. 选择“文件” -> 自动化> “Photomerge”
      3. 选择“浏览”，然后添加所有要合并的图像文件。
      4. 确保选择“Blend Images”，然后选择“OK”。
      5. 将整个目标区域的最终拼接图像保存为TIFF文件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重铬酸钾	Fisher Scientific	P188-100	危险品
铬酸钾	Fisher Scientific	P220-100	危险品
氯化汞	Fisher Scientific	S25423	危险品
Whatman 1号滤纸	Fisher Scientific	1001-185
异氟烷	Pharmaceutical Partners of Canada	CP0406V2
20 mL 闪烁瓶	Fisher Scientific	03-337-4
蔗糖	Bioshop Canada	SUC700.1
磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	S5011-500G
磷酸氢二钠	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL 锥形管	Fisher Scientific	12-565-271
异戊烷	Fisher Scientific	AC126470010	又称2-甲基丁烷。危险品
琼脂	Sigma Aldrich	A1296-100G
小型称量皿	Fisher Scientific	02-202-100
振动切片机	Leica	VT1000 S
6孔组织培养板	Fisher Scientific	08-772-1b
带网底的组织培养小室	Fisher Scientific	07-200-214
多聚甲醛，16%	Electron Microscope Sciences	15710-S	危险品
氢氧化铵	Fisher Scientific	A669S-500	危险品
Kodak 定影液 A	Sigma Aldrich	P7542
Superfrost plus 载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv 透明剂	Fisher Scientific	22-143-975
无水乙醇	Commercial Alcohols	N/A
焦油紫	Sigma Aldrich	C1791
Permount 封片剂	Fisher Scientific	SP15-100
正置显微镜	Olympus	BX53 型号
12 位彩色相机	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging 部件号 01-MBF-2000R-F-CLR-12
三维电动显微镜载物台、控制器及编码器	MBF Biosciences	N/A	由 MBF Biosciences 提供并集成至显微镜
4x 显微镜物镜	Olympus	4x 0.16 数值孔径 UplanSApo
10x 显微镜物镜	Olympus	10x 0.3 数值孔径 UPlan FL N
30x 显微镜物镜	Olympus	30x 1.05 数值孔径 UPlanSApo
60x 显微镜物镜	Olympus	60x 1.42 数值孔径 PlanAPO N
硅油浸油	Olympus	Z-81114
Neurolucida 软件	MBF Biosciences	版本 10
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	当前版本	需安装 OME Bio-Formats 插件
Photoshop 软件	Adobe	CS6 版本