小鼠脑切片中海马神经元激活的成像

摘要

来源：Provenzano, G.，等. 神经发育障碍小鼠模型中空间学习后海马神经元活动的免疫组织化学可视化。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了利用免疫组织化学成像技术来观察海马区神经元的激活情况。经染色的脑切片在明场显微镜下显示出较深的区域，表明神经元已被激活。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 免疫组织化学

1. 将每只小鼠的3-5个背侧海马切片转移至24孔板中，每孔加入500 µl 0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 用500 µl的0.1 M PBS洗涤各孔中的切片（每次5分钟，共洗3次，轻轻振荡）。
3. 通过将切片在1%过氧化氢（H₂O₂）中孵育以淬灭内源性过氧化物酶活性₂O₂) 在 PBS 中轻轻振荡孵育 20 分钟。
4. 用0.1 M PBS轻轻振荡洗涤切片（3次，每次5分钟）。
5. 组织通透化：将切片置于含0.2% Triton X-100的PBS中孵育5分钟。
6. 在上述步骤（1.4；1.5）中，配制足够的封闭缓冲液（PBS 中含 10% 马血清和 0.1% Triton-X100），用于整个实验（切片数量 × 100 µl × 3 步骤）。
7. 注意： 使用与标记生物素的二抗（Ab）同一物种来源的血清。
8. 通过在室温下轻轻振荡孵育封闭缓冲液（每张切片100 µl）1小时，以防止抗体的非特异性结合。
9. 在封闭缓冲液中稀释一抗磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK），4 °C 轻柔振荡孵育过夜。
10. 用0.1 M PBS轻轻振荡洗涤切片（3次，每次5分钟）。
11. 在室温下，用封闭缓冲液（与步骤1.6中所用相同）按1:250稀释的生物素标记的二抗孵育1小时，轻柔振荡。
12. 同时配制亲和素-生物素复合物（ABC）试剂，因为亲和素与生物素在室温下至少需要30分钟才能形成复合物。
13. 根据制造商的说明书配制所需体积的ABC试剂。
14. 用0.1 M PBS轻轻振荡洗涤切片（3次，每次5分钟）。
15. 室温下用ABC试剂孵育切片45分钟。
16. 用0.1 M PBS轻轻振荡洗涤切片（3次，每次5分钟）。
17. 配制二氨基联苯胺（DAB）工作液时，所有涉及DAB的操作均须在通风橱中进行，因为DAB具有致癌性和致畸性。
18. 使用塑料移液管将DAB溶液转移至新培养板中。
19. 将切片放入含有DAB工作液的培养皿中，用手轻轻摇晃培养皿，使切片充分接触溶液。
20. 在显微镜下监测DAB反应，直至出现足够信号（2-5分钟）。
21. 在达到理想的颜色强度后，用 0.1 M PBS 洗涤组织（3 次，每次 5 分钟）以终止反应。
22. 在通风橱中使用漂白剂使残留的DAB底物溶液在过夜后失活，并根据实验室规定进行处理。
23. 将切片在 PBS 中漂浮后贴附于明胶包被的载玻片上，随后在室温下干燥至少 3–4 小时。
24. 依次使用50%、70%、95%和100%乙醇对切片进行脱水，每级乙醇处理2分钟，然后在100%二甲苯中透明5分钟。
25. 用封片剂封片，并置于通风橱中过夜干燥。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	Sigma	CLS3524
100% 乙醇	Fisher Scientific	A406-20	用于制备脱水梯度乙醇，以在载玻片封片前进行脱水处理。
二甲苯	VWR	66004-950	有毒——需在通风橱中使用。根据使用频率每月更换一次二甲苯。
PBS	Sigma	P3813-10PAK
Triton X-100	Sigma	T-8787
过氧化氢	Sigma	H1009-100ML
正常山羊血清	Abcam	G9023-10ML
ABC试剂盒 Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	加入5 ml PBS，2滴试剂A，混匀，然后加入2滴试剂B，再次混匀。
DAB过氧化物酶底物	Vector Laboratories	SK-4100	加入5 ml双蒸水：2滴缓冲液储备液，混匀；4滴DAB，混匀；2滴过氧化氢，混匀。
pERK抗体	Cell Signaling Technologies	4370	稀释比例1:500
生物素标记山羊抗兔IgG抗体	Vector Laboratories	BA-1000	稀释比例1:250
SuperFrost载玻片	Carl Roth	1879
盖玻片	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	载玻片封片介质。可使用等效的封片介质。