利用基于FRET的传感器在小鼠海马脑片中成像细胞内ATP动态变化

摘要

来源：Lerchundi, R.，等．利用基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK对小鼠脑组织器官型切片中的细胞内ATP进行成像．J. Vis. Exp. （2019）

本视频展示了使用基于FRET（荧光共振能量转移）的传感器来测量小鼠海马组织切片中细胞内ATP水平的方法，从而实现对生理和实验条件下神经元和星形胶质细胞中ATP动态变化的实时可视化。

方案

所有涉及动物样本的操作均已被相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 基于FRET的ATP成像（图1）

1. 实验前，准备好E-ACSF，并用95% O₂/5% CO₂持续充气至少30分钟，使其pH值达到7.4。打开单色器的荧光光源（氙灯）（图1）。在将脑片从孵育器中取出前，立即开始灌流。
   注意：整个实验过程中，需持续用95% O₂和5% CO₂对灌流液进行充气。
2. 将脑片转移至实验腔室，使用蠕动泵持续灌注新近用碳合气体饱和的E-ACSF（图1）。然后用网格固定脑片。将腔室置于显微镜载物台上，并连接灌流系统。建议使用防气渗漏的实验室管路进行灌流。
   注意：实验可在室温或接近生理温度下进行，具体取决于实验设计。检查灌流系统的稳定性和可靠性，以避免因组织移动和/或剪切应力变化导致的焦距偏移。我们实验室及许多其他实验室常用的脑片灌流标准流速为1.5–2.5 mL/min。
3. 使用透射光将培养的脑片调至清晰对焦。确定实验区域（例如：海马CA1区）。在开始成像实验前，至少等待15分钟，使脑片适应灌流液环境。实验装置的配置参见图1。
4. 打开相机和成像软件，然后选择合适的滤光镜组。
5. 在435/17 nm（约435 nm）处激发供体荧光蛋白（eCFP）。将曝光时间设定在40至90 ms之间。
   注意：强荧光光照可能对脑片产生光毒性效应。
6. 在435 nm激发下，可同时在475 nm（eCFP；供体）和527 nm（Venus；受体）处产生发射光。使用发射光图像分光器在500 nm处分离荧光发射，并采用483/32和542/27带通滤光片进一步分离供体和受体荧光。过强的表达可能导致探测器饱和；此时可使用中性密度滤光片降低激发光强度。
7. 选择一个明显无细胞荧光的区域作为背景扣除区域（ROI）。然后创建勾画细胞体的感兴趣区域（ROI）。
8. 设定图像采集频率和总记录时间。对于长时间（>30 min）实验，建议采用0.2–0.5 Hz的采集频率，以减少光毒性。
9. 开始记录。建议在基线条件下至少记录5分钟，以确保样本的稳定性。
   注意：记录过程中可根据需要调整细胞的焦距。

结果

图1： FRET成像系统的配置。 （A）FRET成像系统所需各组件及其空间排列的示意图。该系统包括以氙灯为光源的单色器、直立式固定载物台显微镜（1）、图像分光系统（2）、用于延时记录的数字CCD或CMOS相...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-脱氧葡萄糖	Alfa Aesar	L07338	不可代谢的葡萄糖类似物
带通滤光片 483/32	AHF Analysentechnik AG		分光器兼容的发射滤光片
带通滤光片 542/27	AHF Analysentechnik AG		分光器兼容的发射滤光片
分光镜 T 455 LP	AHF Analysentechnik AG		激发用二向色镜
分光镜 T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG		分光器用二向色镜
数据处理 Origin Pro 9.0.0 (64位)	OriginLab corporation		科学绘图与数据分析软件
D-葡萄糖一水合物	Caelo	2580-1kg
DPBS	GIBCO/Life	14190250	杜氏磷酸盐缓冲液
Eclipse E 600FN 直立显微镜	Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 直立显微镜	Nikon Microscope Solutions
实验腔室	custom build		用于活细胞成像的灌流腔室
Hanks' 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H9394	含酚红用于pH监测
Eagle最低必需培养基	Sigma-Aldrich	M7278	合成细胞培养基
单色仪 Polychrome V	Thermo Scientific/FEI		超快速切换单色仪
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		水浸式显微镜物镜
NIS Elements 4.50 advanced Research	Nikon Microscope Solutions		成像软件，FRET成像升级版本
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics		数字CMOS相机
灌流管路	Pro Liquid GmbH		Tygon管路，1.52 x 322 mm（内径：0.85）
Photoshop CS 6 版本 13.0	Adobe		图像处理软件
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich	v244	单链AAV载体，可在人突触素1启动子片段hSyn1的调控下诱导ATeam1.03YEMK的表达。
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	单链AAV载体，可在人胶质纤维酸性蛋白启动子片段ABC1D的调控下诱导ATeam1.03YEMK的表达。