来源：Wang, Z., 等. 小鼠视网膜经瞳孔双光子活体成像. J. Vis. Exp. (2021).
本视频演示了一种利用双光子显微镜进行活体视网膜成像的技术。将麻醉后的小鼠固定头部，涂抹眼用润滑剂，并在眼睛上放置盖玻片以准备成像。首先使用落射荧光法对表达荧光蛋白的视网膜神经节细胞（RGCs）进行可视化定位，随后采用双光子成像技术，实现对RGCs的高分辨率观察。
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方法文章
活体小鼠视网膜的双光子成像
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2025年4月28日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 动物医学评审委员会的审查。
1. 图像采集前小鼠的准备
- 成像前小鼠麻醉
注意：为减少异氟烷暴露，应确保废气有效回收。麻醉诱导舱的排气口须连接至被动废气过滤罐，小鼠麻醉鼻罩的出口须连接至由气体抽吸装置提供负压的主动废气过滤罐。请遵循制造商指南，通过监测过滤罐重量判断是否需要更换。- 使用氯胺酮/赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。或者，若维持麻醉也采用异氟烷（成像时间>30 分钟），则可通过吸入异氟烷诱导麻醉。将小动物麻醉仪设置为....
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结果
图1：活体成像中小鼠的定位。 为使小鼠瞳孔与光路同轴，首先将麻醉后的小鼠固定在头部固定器中，调整头部的旋转角度，然后在眼睛表面滴加一大滴润滑眼用凝胶，再将小鼠放置于载物台上。将盖玻片安装在盖玻片夹持器中，使其垂直于光路，并缓缓向下移动靠近眼球。盖玻片不应接触角膜或小鼠头部（左图），若盖玻片发生偏折则表明已发生接触。但盖玻片也需足够接近，以避免液滴出现缩颈现象（右图），否则会对样本产生缩小效应。在滴加浸润凝胶并固定盖玻片后，应将载物台移动至显微镜物镜正下方的合适位置。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #1.5 盖玻片 | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm × 40 mm |
| 50 mL 玻璃注射器 | Hamilton | 80950 | 22G 固定针头 |
| 麻醉空气泵 | RWD生命科学 | R510-30 | |
| 阿托品 | Sigma | A0132 | 用于瞳孔扩张溶液 |
| 基础小型动物麻醉设备 | RWD生命科学 | R500IE | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter | B150-86-10 | 外径1.50 mm，内径0.86 mm，长度10 cm |
| CFP/YFP滤光片组 | 染色 | 定制 | 480/40，505 长通，535/30 |
| ChromoFlex - 双通道PMT检测单元 | 科学仪器公司 | S-MPLG-1002 | |
| 循环加热泵 | Braintree Scientific | tp-700 | 设定为 37 °C |
| 保鲜膜 | VWR | 10713-916 | |
| 紧凑型滤器支架 | ThorLabs | DH1 | 将盖玻片置于小鼠眼睛上方 |
| Cx3cr1-GFP 转基因小鼠（B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J） | 杰克逊实验室 | 5582 | |
| 数据采集控制器机箱 | 国家仪器公司 | PXIe-1073 | |
| 数据采集设备 | 国家仪器公司 | BNC-2090A | |
| 带数字化仪的 FPGA 模块 | 国家仪器公司 | NI-5734 | |
| 气体排出装置 | RWD生命科学 | R546W | |
| GenTeal 重度润滑眼用凝胶 | 爱尔康 | （来自当地药店） | 用于成像过程中 |
| GFP/Red滤光片组 | Chroma | 定制 | 535/30，560 长通，605/70 |
| 加热垫 | McKesson 医疗与外科 | 190147 | |
| HyperScope 启动光学组件，用于与普克尔斯盒配合使用 | 科学仪器公司 | S-MP-101080 | |
| HyperScope 主模块 | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope 扫描路径 | 科学仪器公司 | S-MP-100406 | |
| HyperScope X 扫描振镜模块 | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ Fiji 软件 | 免费软件 | ||
| 异氟烷 | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| 异氟烷气体过滤罐（主动吸附） | RWD生命科学 | R510-31 | |
| 异氟烷气体过滤罐（被动式废气清除） | RWD生命科学 | R510-31S | |
| 盐酸氯胺酮（100 mg/mL） | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| M32 至 M26 转接器 | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI 软件 | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB 软件 | MathWorks | NA | R2015b |
| 美洛昔康（5 mg/mL） | 勃林格殷格翰 | NDC 0010-6013-01 | 镇痛药 |
| 显微镜物镜 | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter | Flaming/Brown 型 P-97 拉针仪 | |
| 矿物油 | Fisher | BP2629-1 | |
| 迷你斗牛犬止血钳 | 精细科学工具 | 18053-28 | |
| 微型EVA管，内径0.02英寸，外径0.06英寸 | McMaster Carr | 1883T1 | |
| 微型EVA管，内径0.05英寸，外径0.09英寸 | McMaster Carr | 1883T4 | |
| 小鼠头部固定器 | Narishige | SGM-4 | |
| 5号镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 1/2英寸光学柱 | ThorLabs | TR3-P5 | |
| 光学功率计套件 | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG 递送 | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
| 盐酸去甲肾上腺素 | Sigma | P6126 | 用于瞳孔扩张液 |
| 普克尔斯盒 | Conoptics | 350-80-02 | |
| 普克尔斯盒放大器 | Conoptics | Model 302RM | |
| 盐酸丙帕他卡因 | Sigma | 1571001 | 用于眼球固定 |
| 红色 & 远红短通滤光片模块 | Chroma | 定制 | 560 短通 |
| 旋转式1/2英寸立柱夹 | ThorLabs | SWC | |
| ScanImage 软件包 | Vidrio Technologies | 免费软件 | 图像采集软件；版本 5.4.0（2018）；需要 MATLAB |
| 氯化钠溶液，无菌（0.9%） | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| 体视显微镜 | Leica | S9 E | |
| 台式离心机 | 牛津 | Benchmate C8 | |
| 土霉素/多粘菌素B抗生素眼膏 | Zoetisus | NA | 玻璃体内注射后使用 |
| ThermoRack 冷却系统 | 固态冷却系统 | ThermoRack 401 | 设定为 20 °C |
| 超快钛宝石激光器 | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre 转基因小鼠 (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | 杰克逊实验室 | 16962 | |
| VGlut2-Cre 转基因小鼠 (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | 杰克逊实验室 | 16963 | |
| 活体成像用VivoScope | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| 白色凡士林-矿物油润滑眼膏 | 麦粒肿 | NA | 成像后使用 |
| 盐酸赛拉嗪（20 mg/mL） | Akorn | NDC 59399-110-20 |
