来源：Wang, Z., 等. 小鼠视网膜经瞳孔双光子活体成像. J. Vis. Exp. (2021).
本视频演示了一种利用双光子显微镜进行活体视网膜成像的技术。将麻醉后的小鼠固定头部，涂抹眼用润滑剂，并在眼睛上放置盖玻片以准备成像。首先使用落射荧光法对表达荧光蛋白的视网膜神经节细胞（RGCs）进行可视化定位，随后采用双光子成像技术，实现对RGCs的高分辨率观察。
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活体小鼠视网膜的双光子成像
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2025年4月28日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 动物医学评审委员会的审查。
1. 图像采集前小鼠的准备
- 成像前小鼠麻醉
注意：为减少异氟烷暴露，应确保废气有效回收。麻醉诱导舱的排气口须连接至被动废气过滤罐，小鼠麻醉鼻罩的出口须连接至由气体抽吸装置提供负压的主动废气过滤罐。请遵循制造商指南，通过监测过滤罐重量判断是否需要更换。- 使用氯胺酮/赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。或者，若维持麻醉也采用异氟烷（成像时间>30 分钟），则可通过吸入异氟烷诱导麻醉。将小动物麻醉仪设置为以 0.5 L/min 的流速向诱导舱输送含 5% 异氟烷的室内空气。将小鼠放入诱导舱内，等待约 15 秒使其进入麻醉状态。
- 将异氟烷蒸发器调至 0%，并将麻醉气流导向鼻罩。对诱导舱执行一次持续 5 秒的“O2 冲洗”。取出小鼠，将其固定于头部固定装置，并连接鼻罩。
- 以 1% 异氟烷与室内空气混合、流速为 0.5 L/min 的条件维持麻醉。在整个麻醉过程中每 5 分钟监测一次呼吸频率，并调整异氟烷浓度，使呼吸频率维持在约 60 次/分钟。
注意：上述参数（异氟烷浓度、流速）也可用于氯胺酮/赛拉嗪混合物诱导后的麻醉维持。
- 瞳孔散大
- 配制含 1% w/v 阿托品和 2.5% w/v 盐酸去氧肾上腺素的水溶液。将散瞳液避光、室温保存。
- 使用一次性移液器滴管，向待成像的每只眼睛滴加一滴散瞳液。关闭室内灯光，等待 5 分钟使瞳孔充分散大。瞳孔散大后，用无绒纸巾吸除残留的散瞳液。
注意：确保散瞳液不进入鼻腔。 - 向每只待成像的眼睛滴加大量润滑性眼用凝胶。若需对双眼成像，则在非成像眼的眼凝胶上覆盖一小片塑料保鲜膜以防止脱水；若仅成像单眼，则在非成像眼涂抹润滑性眼膏。
- 成像时小鼠体位摆放
- 为将小鼠固定于成像用头部固定装置，旋转主臂，使耳棒低于水平方向 60° 或更大角度。将下耳道针固定于向内伸出位置，上耳道针置于回缩位置。
- 使小鼠面部朝向咬杆，将一侧耳朵套入伸出的下针，将针插入耳道。松开固定上耳道针的螺丝，将针伸入另一侧耳道，然后拧紧螺丝以固定头部。
- 将咬杆向小鼠头部方向滑动。轻轻抬起小鼠头部，使其上颌门齿落入咬杆孔中。轻力回拉咬杆以固定头部，并通过拧紧螺丝固定咬杆位置。
- 若使用异氟烷，应在固定小鼠门齿前，先将鼻罩穿过其插槽安装至咬杆。参照步骤 1.3.3 固定并拧紧咬杆位置。通过拧紧鼻罩上表面的两个螺丝，使其紧密贴合小鼠鼻部，但不得压迫吻部。
- 将固定于头部固定装置的小鼠转移至物镜下方的显微镜载物台上。旋转头部固定装置的主臂，使眼睛瞳孔垂直向上，与光路对齐（图 1）。
- 将一片 #1.5 盖玻片放入紧凑型滤光片 holder 中，并将 holder 安装至显微镜载物台。将盖玻片缓慢下移接近眼球，接触润滑性眼用凝胶，使其水平地位于角膜正上方（图 1）。确保盖玻片不接触角膜。
注意：在显微镜上，确保激发光路设置为落射荧光模式，发射光路设置为目镜观察模式。将落射荧光光源调至最低功率并打开光源快门。根据所成像的荧光染料选择相应的激发波长和荧光滤光片。 - 通过载物台控制和电动聚焦驱动调节载物台的 X-Y 位移及物镜的 Z 轴位置，使宽场激发光完全覆盖角膜。通过目镜观察，继续调节载物台 Z 轴位置，直至视网膜中的荧光细胞或结构清晰对焦。若通过目镜观察时样本信号过弱，无法分辨单个细胞或目标结构，可适当提高落射荧光光源功率。
注意：若难以定位视网膜，可先以高对比度的虹膜为参考标志，对焦后继续向下调节至视网膜。此步骤也可用于确认瞳孔是否已充分散大。 - 调整小鼠角度，利用头部固定装置的多自由度调节功能，使在改变焦平面时仅出现离焦光斑的扩大或缩小，而无其他位移。关闭落射荧光光源并关闭光源快门。
注意：在沿 Z 轴切换焦平面时，若离焦光出现明显的 X-Y 方向视差，表明视网膜未与成像光路同轴。
2. 双光子图像采集
- 成像设置与采集参数
注意：关闭室内灯光，并遮蔽房间内的杂散光源。确保落射荧光照明器处于关闭状态，且照明器快门已关闭。- 将激发光路切换至激光，发射光路切换至光电倍增管（PMTs）。
- 在图像采集软件中，设置帧大小为 512 × 512，帧平均值为 3。设置每层步进为 -8 µm。指定 z 轴步进从堆栈顶部开始向下进行，以尽量减少双光子激光对光感受器的激活。
注意：可减小步长以提高 Z 轴分辨率，但会增加成像时间；在此成像配置下，8 µm 的步长已足以分辨细胞胞体。 - 开启并启用光电倍增管（PMTs），将 PMT 电压调节至 680 V，并启用激发光快门。
注意：通电状态下的 PMT 易受光照损伤。请确保落射荧光照明器已关闭，显微镜遮光帘已拉上，且室内灯光已关闭。 - 开始对目标组织进行实时图像预览，起始激光功率设为 1%。自动调节显示亮度以清晰观察目标细胞或结构，并自动调整扫描相位。若目标组织信号较弱或不清晰，可逐步提高激光功率百分比，直至结构可见，但不得超过步骤 2.4.4 中设定的限值，即 45 mW。
注意：对于 16 位图像，在包含目标结构的 Z 平面中，自动调节亮度时显示值约为 1000，表明样品亮度已足够。 - 在 X-Y 方向上移动显微镜载物台，使目标成像区域居中，然后定位至目标结构清晰对焦的 Z 平面。
注意：在视神经乳头附近成像，可将其作为慢性成像实验中明确的解剖标志。 - 若为慢性时间序列实验，可在采集计算机上打开先前的图像作为参考，以定位相同的兴趣区域。确保成像角度与之前图像相近，以便以最小视差获取相同细胞群。
注意：为与先前时间点成像相同的细胞（图 2），通常需要进一步调整小鼠头部位置。 - 通过定位至最上层和最下层感兴趣的 Z 平面，设定成像堆栈的 Z 轴范围，并进行图像采集。采集完成后，关闭 PMT 和发射光路快门。将发射光路切换回目镜，激发光路切换回落射荧光照明。将小鼠从显微镜载物台上取下。
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结果
图1：活体成像中小鼠的定位。 为使小鼠瞳孔与光路同轴，首先将麻醉后的小鼠固定在头部固定器中，调整头部的旋转角度，然后在眼睛表面滴加一大滴润滑眼用凝胶，再将小鼠放置于载物台上。将盖玻片安装在盖玻片夹持器中，使其垂直于光路，并缓缓向下移动靠近眼球。盖玻片不应接触角膜或小鼠头部（左图），若盖玻片发生偏折则表明已发生接触。但盖玻片也需足够接近，以避免液滴出现缩颈现象（右图），否则会对样本产生缩小效应。在滴加浸润凝胶并固定盖玻片后，应将载物台移动至显微镜物镜正下方的合适位置。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #1.5 盖玻片 | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm × 40 mm |
| 50 mL 玻璃注射器 | Hamilton | 80950 | 22G 固定针头 |
| 麻醉空气泵 | RWD生命科学 | R510-30 | |
| 阿托品 | Sigma | A0132 | 用于瞳孔扩张溶液 |
| 基础小型动物麻醉设备 | RWD生命科学 | R500IE | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter | B150-86-10 | 外径1.50 mm，内径0.86 mm，长度10 cm |
| CFP/YFP滤光片组 | 染色 | 定制 | 480/40，505 长通，535/30 |
| ChromoFlex - 双通道PMT检测单元 | 科学仪器公司 | S-MPLG-1002 | |
| 循环加热泵 | Braintree Scientific | tp-700 | 设定为 37 °C |
| 保鲜膜 | VWR | 10713-916 | |
| 紧凑型滤器支架 | ThorLabs | DH1 | 将盖玻片置于小鼠眼睛上方 |
| Cx3cr1-GFP 转基因小鼠（B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J） | 杰克逊实验室 | 5582 | |
| 数据采集控制器机箱 | 国家仪器公司 | PXIe-1073 | |
| 数据采集设备 | 国家仪器公司 | BNC-2090A | |
| 带数字化仪的 FPGA 模块 | 国家仪器公司 | NI-5734 | |
| 气体排出装置 | RWD生命科学 | R546W | |
| GenTeal 重度润滑眼用凝胶 | 爱尔康 | （来自当地药店） | 用于成像过程中 |
| GFP/Red滤光片组 | Chroma | 定制 | 535/30，560 长通，605/70 |
| 加热垫 | McKesson 医疗与外科 | 190147 | |
| HyperScope 启动光学组件，用于与普克尔斯盒配合使用 | 科学仪器公司 | S-MP-101080 | |
| HyperScope 主模块 | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope 扫描路径 | 科学仪器公司 | S-MP-100406 | |
| HyperScope X 扫描振镜模块 | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ Fiji 软件 | 免费软件 | ||
| 异氟烷 | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| 异氟烷气体过滤罐（主动吸附） | RWD生命科学 | R510-31 | |
| 异氟烷气体过滤罐（被动式废气清除） | RWD生命科学 | R510-31S | |
| 盐酸氯胺酮（100 mg/mL） | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| M32 至 M26 转接器 | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI 软件 | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB 软件 | MathWorks | NA | R2015b |
| 美洛昔康（5 mg/mL） | 勃林格殷格翰 | NDC 0010-6013-01 | 镇痛药 |
| 显微镜物镜 | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter | Flaming/Brown 型 P-97 拉针仪 | |
| 矿物油 | Fisher | BP2629-1 | |
| 迷你斗牛犬止血钳 | 精细科学工具 | 18053-28 | |
| 微型EVA管，内径0.02英寸，外径0.06英寸 | McMaster Carr | 1883T1 | |
| 微型EVA管，内径0.05英寸，外径0.09英寸 | McMaster Carr | 1883T4 | |
| 小鼠头部固定器 | Narishige | SGM-4 | |
| 5号镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 1/2英寸光学柱 | ThorLabs | TR3-P5 | |
| 光学功率计套件 | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG 递送 | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
| 盐酸去甲肾上腺素 | Sigma | P6126 | 用于瞳孔扩张液 |
| 普克尔斯盒 | Conoptics | 350-80-02 | |
| 普克尔斯盒放大器 | Conoptics | Model 302RM | |
| 盐酸丙帕他卡因 | Sigma | 1571001 | 用于眼球固定 |
| 红色 & 远红短通滤光片模块 | Chroma | 定制 | 560 短通 |
| 旋转式1/2英寸立柱夹 | ThorLabs | SWC | |
| ScanImage 软件包 | Vidrio Technologies | 免费软件 | 图像采集软件；版本 5.4.0（2018）；需要 MATLAB |
| 氯化钠溶液，无菌（0.9%） | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| 体视显微镜 | Leica | S9 E | |
| 台式离心机 | 牛津 | Benchmate C8 | |
| 土霉素/多粘菌素B抗生素眼膏 | Zoetisus | NA | 玻璃体内注射后使用 |
| ThermoRack 冷却系统 | 固态冷却系统 | ThermoRack 401 | 设定为 20 °C |
| 超快钛宝石激光器 | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre 转基因小鼠 (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | 杰克逊实验室 | 16962 | |
| VGlut2-Cre 转基因小鼠 (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | 杰克逊实验室 | 16963 | |
| 活体成像用VivoScope | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| 白色凡士林-矿物油润滑眼膏 | 麦粒肿 | NA | 成像后使用 |
| 盐酸赛拉嗪（20 mg/mL） | Akorn | NDC 59399-110-20 |
