利用颅骨植入物进行神经-免疫动态的荧光成像

摘要

来源：Bisht, K.，等．通过精确脑图谱实现小鼠神经-免疫动态的重复活体成像．J. Vis. Exp. （2020）

本视频展示了在带有颅骨植入物的转基因小鼠中对神经-免疫动态进行的荧光成像。血管和神经的稳定性与小胶质细胞的动态变化同时成像，反映了免疫系统对神经元活动的响应。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 颅窗植入术的小鼠准备

注意： 多种带有荧光标记的转基因小鼠品系均适用于成像。

1. 使用 CX3CR1GFP/+ 小鼠在体内可视化小胶质细胞。通常使用体重为 17–25 g 的幼年至年轻成年小鼠，年龄为 4 至 10 周。
   注意：尽管该方法也适用于哺乳期前小鼠，但若需将小鼠放回母鼠笼中哺乳，而母鼠术后对幼崽照料不周，则可能影响恢复。因此，建议使用断奶后的小鼠。
2. 在麻醉舱中使用异氟烷（5% 异氟烷与氧气混合，诱导麻醉 1 分钟）对小鼠进行麻醉。通过夹捏脚趾和/或尾巴检查小鼠是否无任何运动或抽搐反应。将小鼠从麻醉舱中取出，在开放空气中使用毛发修剪器，彻底剃除两耳之间从眼部水平至颈部顶端区域的毛发。
   注意：所用异氟烷浓度取决于诱导舱的大小。因此，对于较小的舱体，可使用 3–4% 异氟烷有效诱导麻醉，而较大的舱体则需要高达 5% 的浓度。
3. 将小鼠转移至立体定位手术站的鼻罩进行麻醉维持（术中维持浓度为 1.5–2%），使用耳杆固定其头部，并将小鼠置于加热垫上以维持体温。
4. 用眼膏润滑双眼。在切口部位皮下注射 100 µL 0.25% 布比卡因（为小鼠提供持续 8–12 小时的局部镇痛）和 100 µL 4 mg/mL 地塞米松（以减轻手术可能引起的炎症反应）。在进入下一步操作前，让小鼠静置至少 5 分钟。
5. 用碘伏和 70% 酒精交替擦拭三次，清洁已剃毛的头部。使用手术刀或剪刀，从两耳之间颅骨后部区域至两眼之间的额部区域，做一条正中头皮切口。进一步剪开剩余皮肤以暴露颅骨。
6. 用 3% 过氧化氢 (H₂O₂) 清理位于头皮与下方颅骨之间的结缔组织，并根据立体定位坐标确定需要成像的脑区。
   注意：颅骨表面切口处常有少量出血（步骤 1.5）。这种出血通常在 3–5 分钟内自行停止。使用过氧化氢清洁有助于止血。此前的布比卡因处理（步骤 1.4）也被证实可减少此阶段的出血量。

2. 小鼠颅窗植入手术

1. 使用牙科钻头（尖端直径0.7 mm）在颅骨上钻一个直径约4 mm的圆形开口，并用尖头镊子小心移除该部分颅骨。若需对6至8周龄小鼠的体感皮层进行成像，颅窗中心应位于前囟后方-2.5 mm、左右两侧±2.0 mm处。钻孔过程中，需定期用无菌生理盐水和棉签湿润颅骨，以冷却脑组织、清除骨屑，并软化颅骨以便最终移除。
   注意：颅窗的坐标位置会因目标脑区和小鼠年龄的不同而有所变化。
2. 移除颅骨后，将一片经生理盐水湿润的小型盖玻片（#0规格，厚度0.1 ± 0.02 mm）小心放置于颅窗内。用无菌擦拭纸吸去多余的生理盐水。
3. 使用尖头涂布工具（如移液器吸头或折断的木制棉签尖端），在窗口周围涂抹氰基丙烯酸酯胶水，使其与脑组织和颅骨粘合。将底漆胶涂布于颅骨其余区域，并用固化灯照射20–40秒进行固化。围绕窗口用最终胶水构建一个围堰结构，并再次用固化灯照射20–40秒完成固化。
4. 在颅窗对侧半球的颅骨上，先用底漆胶作为底涂，再用最终胶水将一小块头固定板粘附于颅骨上。每次粘接后均用固化灯照射20–40秒进行固化。
   注意：若在操作过程中胶水已完全覆盖颅骨，则无需缝合。

3. 术后护理

1. 让小鼠在无麻醉状态下苏醒（在加热垫上恢复可缩短恢复时间），待其完全清醒后放回原笼具中。皮下注射一剂缓释布托啡诺（0.5 mg/kg），作为术后镇痛，药效可持续72小时。
2. 为促进手术后健康恢复，为小鼠提供额外柔软的食物，例如用水浸泡软化的常规固体饲料，或凝胶状食物。
   注意：手术后立即提供一次软食即可。
3. 在手术后的最初72小时内，每天监测小鼠的健康状况和恢复情况。此后，最早可在术后2周开始进行颅窗植入手术的成像实验。
   注意：若手术操作得当，小鼠应恢复良好，表现为正常的活动行为、充分的笼内探索、良好的水合状态、稳定的体重增长，以及与笼内其他小鼠和物品的积极互动。若小鼠出现嗜睡、脱水，或术后体重减轻超过10%，则应实施安乐死并从实验中剔除。

4. 初始成像的双光子脑图谱绘制

1. 用异氟烷麻醉小鼠（诱导浓度5%，维持浓度1.5%）。使用螺钉将头固定件安装在双光子显微镜载物台上以固定头部，并将小鼠置于35℃加热板上维持体温 ˚C. 腹腔注射 100 µL 血管染料，如罗丹明 B（2 mg/mL）。
   注意： 成像也可在未麻醉的清醒小鼠中进行。然而，近期研究表明，麻醉会影响小胶质细胞的监视动态。在清醒小鼠中进行双光子成像时，头部固定会增加应激反应，即使在至少持续25天的慢性成像过程中也是如此。
2. 用蘸有70%乙醇的棉签轻轻清洁颅窗表面。在颅窗上滴加几滴水或生理盐水，并将物镜浸入溶液中，因为该物镜为浸液式物镜。
3. 通过落射荧光显微镜目镜观察时，在实验记录本中手绘粗略示意图，标示主要血管解剖标志。利用该示意图在双光子成像过程中识别特定区域。或者，可通过显微镜连接的相机、手持相机或手机拍摄血管图像。
   注意： 这些手绘图像和图片旨在帮助在双光子成像前，通过显微镜重新定位到相同的较大区域。这些图像并非精确的图像定位图。
4. 在双光子成像下，根据需要采集荧光细胞和血管的图像。详细记录相应的坐标信息，以确保后续成像时能够准确定位到相同区域。在本次初始成像过程中采集多个视野，例如每隔1-2 μm采集一组z轴层扫图像 µm 通过一定体积的组织。
   注意： 使用双光子成像时，以血管标志物进行粗略定位。若需精细定位，则利用Thy1-YFP小鼠中YFP标记的树突进行。
   1. 使用以下推荐参数进行成像：880–900 nm 的激发波长为最佳；对于 GFP 和/或 dsRed/Rhodamine 激发，采用 565 nm 二向色镜，并搭配 525/50 nm（绿色通道）和 620/60 nm（红色通道）的发射滤光片；为分离 GFP 与 YFP，采用 509 nm 二向色镜，并搭配 500/15 nm 和 537/26 nm 发射滤光片；照射至脑组织的激光功率维持在 25 mW 或以下；图像分辨率为 1024 × 1024 像素，使用 25× 0.9 NA 物镜并在 1.5× 放大倍数下成像时，视场大小为 295.24 × 295.24 µm
5. 成像结束后，将小鼠从成像台上取下，使其从麻醉状态中苏醒，并放回其饲养笼，直至下一次成像实验。

5. 双光子成像与重复成像

1. 对于未来的后续成像实验（可在初次成像后的数小时至数月内进行），使用异氟烷麻醉小鼠（5% 诱导，1.5% 维持），将其固定在双光子显微镜上，置于加热板上保温，并重新注射 100 µl 血管染料（如罗丹明 B，2 mg/mL）。
2. 在 ImageJ 中打开先前获取的图像，并结合这些图像及前次实验的记录，识别先前成像的区域，并仔细重新成像。
3. 根据研究需要，在成像窗口保持清晰的时间范围内重复此过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片（3 mm）	Warner Instruments	64-0726
氰基丙烯酸酯胶水（Krazy Glue）	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED 固化灯系统	Dental Health Products, Inc	910860-1
牙科钻机	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
钻头	Fine Science Tools	#19008-07
眼药膏	Henry Schien	1338333
iBond 全酸蚀粘接剂（底漆胶）	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow 胶水（终粘接胶）	Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1