来源： Heredia, D. J., et. al. 小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号的离体成像。J. Vis. Exp. (2018)
本视频展示了在表达基因编码钙指示剂的转基因小鼠膈肌神经肌肉接头（NMJ）处，钙离子动态的荧光成像。通过膈肌中带有荧光标记的乙酰胆碱受体及膈神经定位神经肌肉接头。使用图像分光器同时可视化多个信号。施加电刺激后，记录神经肌肉接头处因钙离子内流引起的荧光变化。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
转基因小鼠膈肌神经肌肉接头处钙动力学的荧光成像
912 次观看
⸱
2025年5月29日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。
1. 转基因小鼠膈肌和膈神经的制备
- 购买转基因小鼠及用于基因分型的寡核苷酸引物。
- 将一只表达一份适当转基因/基因敲入型 Cre 驱动等位基因且不表达条件型 GCaMP3/6 等位基因的 3 至 6 月龄小鼠，与另一只同龄小鼠（表达一份或两份条件型 GCaMP3/6 等位基因且不表达 Cre 驱动等位基因）进行交配。
- 对幼鼠进行基因型鉴定，并标记出同时携带Cre和条件性GCaMP3/6等位基因的个体——这些小鼠将被称为双转基因小鼠（例如，Myf5-Cre，条件性GCaMP3）。
注意： 这样，所有数据都将来自表达一份Cre和条件性GCaMP3/6等位基因小鼠。当在杂交中引入其他突变小鼠（例如，基因敲除小鼠）时，这一点尤为重要。
- 当双转基因小鼠达到适当年龄（例如出生后0天或5天[P0或P5]或成年）时，对于P10之前的小鼠，使用剪刀剪头处死；对于P10及以后的小鼠，将其置于异氟烷吸入麻醉舱中处死。当小鼠对用镊子夹捏尾部无反应时，即可进行下一步操作。
- 通过剪刀断头法处死动物。
- 用虹膜剪在肝脏下方、心脏和肺部上方横向剪开整个动物体。
- 小心地分离肝脏、心脏和肺，同时注意保留足够长度的膈神经，以便能够插入至吸出电极中（即 1 - 2 cm）。
注意： 左侧膈神经可辨认为一条进入左膈肌内侧部分的白色组织，去除肺脏时不得切断该神经。右侧膈神经走行于一块筋膜内，该筋膜同时包含上腔静脉，且膈神经比上腔静脉更细、更白。两者共同穿入右侧膈肌内侧部。 - 进一步去除肋骨和脊柱，仅保留膈肌周围的一圈薄脊。
- 将膈肌和膈神经样本置于含有 Krebs-Ringer 溶液的微量离心管中 1 µg/mL 594-α在避光条件下使用 BTX 处理 10 分钟。
注意： 该浓度的594-αBTX 在标记乙酰胆碱受体（AChRs）的同时不阻断其功能（个人观察）。
2. 肌肉动作电位的刺激与记录
- 使用微型固定针将膈肌固定在涂有硅胶介电凝胶的6 cm培养皿中，并加入约8 mL充氧的Krebs-Ringer溶液，然后将培养皿置于显微镜载物台上。以8 mL/min的流速灌注Krebs-Ringer溶液，持续30分钟。
注意：此步骤可洗去未结合的594-αBTX，同时使组织在解剖后达到平衡状态。 - 按照既定方法制备吸吮电极。
- 在4倍放大倍率下，使用显微操作器将吸吮电极移至左侧膈神经上方，并通过拉动连接至吸吮电极管路的5 mL注射器筒管施加负压。
注意：当膈神经成功被吸入吸吮电极时，神经呈拉紧状态。打开刺激器，通过手动开关触发一次刺激。 - 通过明场照明目视观察膈肌是否对1 Hz刺激产生收缩反应。若无反应，逐步调节电压旋钮以提高电压，直至达到超最大刺激脉冲，可通过肉眼观察肌肉收缩来确认。若仍无可见反应，用注射器将神经吹出，再次施加负压尝试吸入。
- 在4倍放大倍率下，使用显微操作器将吸吮电极移至左侧膈神经上方，并通过拉动连接至吸吮电极管路的5 mL注射器筒管施加负压。
- 关闭灌注系统，加入肌肉特异性肌球蛋白抑制剂BHC6或电压门控钠通道拮抗剂µ-conotoxin，使其终浓度达到100 µM。
- 配制100 µM BHC：取4 µL 200 mM DMSO储备液，用1 mL Krebs-Ringer溶液预稀释。
- 从培养皿中移除1 mL Krebs-Ringer溶液。
- 将预稀释的BHC加入培养皿中。
注意：此预稀释步骤有助于防止未稀释的DMSO在表达GCaMP3的细胞中诱导出非瞬时的荧光反应。 - 等待30分钟，然后重新开启新鲜Krebs-Ringer溶液的灌注，持续20–30分钟。
- 准备记录电极。
- 佩戴手套，将一根外径（OD）为1 mm、内径（ID）为0.4 mm的含丝硼硅酸盐玻璃毛细管插入微电极拉制仪中，旋紧旋钮将其固定到位，并关闭拉制仪门。
- 使用P-97拉制仪，设置以下参数：加热温度900，拉力120，速度75，时间250，压力500，不设额外循环。
注意：电阻（R）通过放大器的软件控制进行测量：数据采集软件通过求解公式V = IR来确认电阻值。软件控制器向电极施加已知电流（I）（通常为1 nA），并测量电压变化（V），从而可计算出R。 - 对于胚胎期膈肌，确保电阻接近60 MΩ；对于较年长的膈肌，电阻应在10–20 MΩ之间。用3 M氯化钾（KCl）填充记录电极。
- 在10倍放大倍率下，使用另一侧的显微操作器将电极插入肌肉中，作为刺激电极。
- 使用电生理数据采集软件，等待静息膜电位从0 mV降至-65 mV或更低。
- 以1 Hz频率进行刺激，并通过检测是否存在大幅电位（起始电位为-65 mV或更低时，电位上升超过0 mV并略有超调）来确认肌肉动作电位的存在。注意不要将刺激伪影与动作电位混淆。
注意：动作电位的持续时间显著长于刺激伪影（约5 ms）。
3. 样品荧光成像
- 在20倍放大倍率下，通过在绿/黄光激发（550 nm）下观察用594-αBTX标记的神经肌肉接头（NMJ），定位肌肉中央的终板带。切换至蓝光激发（470 nm）以成像肌细胞、运动神经元或施万细胞中的Ca2+响应。
- 如需要，使用带通滤光片和单边二向色滤光片设置图像分光器，用于双波长成像。
- 为计算表达GCaMP3/6的组织所表现出的最大荧光强度（Fmax），向膈肌制备样本中加入12 µL的3 M氯化钾（KCl）。
- 在KCl刺激下，以20倍放大倍率且无像素合并的条件下，将GCaMP3/6表达组织的荧光饱和水平作为基准，将查找表条上的亮度条设置为该基准的110%，并在此设置下进行实验。
- 以每秒20帧的速度进行记录，以避免遗漏任何快速事件。
- 使用吸电极施加1–45秒、频率为20–40 Hz的神经刺激，或通过浴式给药或灌流添加药理学激动剂，同时采集一种细胞亚型的动态荧光Ca2+响应信号以及静态的594-αBTX标记的NMJ信号。
注意：若可用于NMJ研究的组织特异性红色或远红光遗传编码钙指示剂（GECI）或遗传编码电压指示剂（GEVI）小鼠模型可获得，则可用于同时采集反映NMJ中两个不同细胞组分的动态信号。 - 当成像或电生理实验因达到预期结果而结束时，通过灌流管路灌注清水，并通过吸电极抽吸清水2–3次，以确保盐类不会积聚。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Myf5-Cre 小鼠 | |||
| Wnt1-Cre 小鼠 | |||
| Sox10-Cre 小鼠 | |||
| 条件性 GCaMP3 小鼠 | |||
| 条件性表达 GCaMP6f 的小鼠 | |||
| BHC（3-(N-丁基乙亚胺酰基)-4-羟基-2H-香豆素-2-酮） | |||
| CF594-α-BTX | |||
| µ-芋螺毒素 GIIIb | |||
| 硅酮介电凝胶；又称Sylgard | |||
| Minutien 针（直径 0.1 mm） | |||
| 尼康Eclipse FN1正置显微镜 | |||
| 基础固定式显微镜平台配手动XY显微镜位移器 | |||
| 手动显微操作器 | |||
| 微电极放大器 | |||
| 微电极低噪声数据采集系统 | |||
| 微电极数据分析系统 | |||
| 方波刺激器 | |||
| 刺激隔离单元 | |||
| 硼硅酸盐细丝，外径 1.0 mm，内径 0.5 mm | |||
| 硼硅酸盐细丝，外径1.5 mm，内径1.17 mm | |||
| 微移液管拉制仪 | |||
| 1200x1200像素，背照式cMOS相机 | |||
| 光源 | |||
| 无限远校正荧光浸水物镜，工作距离 2 mm | |||
| 卤素灯光纤光源 | |||
| W-View Gemini 图像分光器 | |||
| 单通带带通滤光片（512/25-25 和 630/92-25） | |||
| 560 nm 单边二向色分光镜 | |||
| 成像数据采集系统 | |||
| 波长控制模块 | |||
| 发射分光器硬件模块 | |||
| 成像数据分析系统 |
