来源： Espinoza, R., et al．利用实时双色受激拉曼散射成像技术对小鼠脑组织进行组织学诊断． J. Vis. Exp. (2022)．
该视频展示了小鼠脑组织切片的双色受激拉曼散射（SRS）成像。两束同步的激光被引导至组织切片，以激发分子振动，从而引起光束相对强度的变化。利用激光束的不同频率对分别检测组织中的脂质和蛋白质。随后将获得的信号赋予不同的颜色，生成一幅双色图像，有助于识别组织中的蛋白质和脂质。
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双色受激拉曼散射成像小鼠脑组织
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2025年5月29日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。
1. 受激拉曼散射信号检测
- 电光调制（EOM）
注意：使用20 MHz的EOM对斯托克斯光束的振幅进行调制。如后文所述，该EOM信号源自80 MHz的激光脉冲序列，这是实现正交调制所必需的。如果仅进行单色或高光谱SRS成像，则可使用其他调制频率，此时无需将调制频率与激光重复频率同步。可使用射频（RF）功率放大器驱动的信号发生器来驱动EOM，从而跳过步骤1.1.1–1.1.4。- 在斯托克斯光束路径中放置一个分束器，拾取10%的光束并将其导入高速光电探测器，以检测80 MHz的脉冲序列。
注意：将光电探测器信号送入分频器，以生成20 MHz的TTL输出。该输出进一步送入扇出缓冲器，复制为四个相同的20 MHz输出。其中一个输出用于触发示波器。 - 取扇出缓冲器的一个输出，通过带通滤波器滤波，获得20 MHz的正弦波。使用射频衰减器将输出的峰峰值电压调节至约500 mV。
- 将所得输出送入相位调节器，利用电压源精细调节射频相位。再将该输出送入射频功率放大器，并将放大器输出连接至EOM。
- 解除斯托克斯光束的遮挡，并在光路中放置一个光电探测器，以优化EOM1的调制深度。调节EOM电压和四分之一波片，直至调制深度（谷值与峰值之比）达到满意水平。
注意：在20 MHz调制（激光重复频率的1/4）下，每50 ns应出现两个脉冲。
- 在斯托克斯光束路径中放置一个分束器，拾取10%的光束并将其导入高速光电探测器，以检测80 MHz的脉冲序列。
- 时间重合
注意：通过将其中一个激光脉冲序列引入安装在延迟平台上的反射镜进行延迟，实现泵浦光与斯托克斯光的时间重合（图1显示斯托克斯光被延迟）。粗略重合通过示波器监测，精细重合通过SRS信号监测。如有条件，也可使用自相关仪实现精细时间重合。- 在二向色镜后放置一个光电探测器以检测激光束。首先遮挡斯托克斯光束。在示波器上放大其中一个泵浦脉冲的峰值，并使用垂直光标标记该峰值的时间位置。
- 遮挡泵浦光束，解除斯托克斯光束的遮挡。平移延迟平台，使示波器上斯托克斯脉冲的峰值位置与上一步标记的位置重合。时间重合效果如图2所示。
- （可选）若延迟平台的移动范围不足以实现两束光的时间重合，则将延迟平台移至其运动范围的中间位置。
- 通过计算两束光之间的时间差，并将该时间差乘以光速，得到为实现时间重合所需调整的延迟距离。
- 相应地延长较快光束的光路，或缩短较慢光束的光路，以大致匹配时间延迟。
- 准备一个载玻片样品，使用二甲基亚砜（DMSO）和双面胶作为间隔物，将样品夹在载玻片与盖玻片之间。
- 将样品放置在显微镜上，盖玻片一侧朝向显微镜物镜。切换至明场照明模式，通过目镜观察样品。首先在玻璃-胶带界面的气泡上下两层找到焦点，然后将焦点移至两层胶带之间。
注意：在观察目镜前，确保激光束已被遮挡。 - 将可调谐激光器输出设为798 nm。根据聚光镜的光学透过率，调节泵浦光和斯托克斯光在物镜焦点处的光功率，均约为40 mW。
- 在MATLAB中打开ScanImage（或其他控制显微镜的扫描软件），点击标有FOCUS的按钮以开始扫描。
注意：激光束将对样品进行光栅扫描以生成图像。光电探测器输出的低频信号（<100 kHz）直接输入数据采集卡的通道1（称为DC通道）。光电探测器输出的高频信号（>100 kHz）输入锁相放大器，锁相放大器的X输出信号送入数据采集卡的通道2（称为AC通道）。 - 调节振镜扫描器前的转向镜，使DC信号在通道1显示中居中。移动电动延迟平台，并密切观察通道2（即AC通道）显示的锁相输出。
注意：当泵浦光与斯托克斯光在时间上重合时，AC通道将出现信号。调整AC通道的颜色标度有助于显示微弱的强度变化。 - 通过精细调节时间延迟，使AC信号强度最大化。调节二向色镜，使SRS信号在AC通道中居中（同时保持DC通道信号居中）。调节锁相放大器的相位以使信号最大化。满意的信号如图3所示。
3. 光谱分辨率优化
注意：为获得最佳光谱分辨率，到达样品的泵浦光束和斯托克斯光束应具有相同的群延迟色散（GDD）量。色散程度高度依赖于实验装置。本文所述实验装置使用波长分别为1,040 nm和800 nm的飞秒脉冲作为斯托克斯光和泵浦光。采用重火石玻璃棒（H-ZF52A）作为脉冲展宽介质。
将一根48 cm长的高色散玻璃棒（H-ZF52A或等效重火石玻璃）插入800 nm光束路径中。使用公式（Eq1):
注意： 不同波长下各种玻璃材料的群速度色散（GVD）可从折射率数据库资源中查得。例如，H-ZF52A 的 GVD 为 220.40 fs2/毫米，在800纳米处。总群延迟色散（GDD）为105792飞秒2.
- 计算需要在1,040 nm光路中加入多少厘米的色散玻璃棒，以匹配泵浦光的群延迟色散（GDD）。将相应长度的色散玻璃棒插入1,040 nm光路中，粗略匹配800 nm光束的GDD。注意，加入玻璃棒会改变两束光之间的时间重叠，可能需要调整延迟。
- 光谱分辨率的校准
- 使用DMSO制备显微镜载玻片样品。将载玻片置于显微镜下，检测显微镜聚光镜出射光束的功率。根据检测结果调节光强，使样品焦点处每束光的功率约为40 mW。
- 开放 ScanImage 来自 MATLAB。通过扫描延迟阶段找到最大的 SRS 信号，该信号对应于 2,913 cm⁻¹-1 DMSO的拉曼峰。根据之前的位置，结合因插入玻璃棒导致的光程增加，估算载物台的新位置。由于加入玻璃棒后光束存在微小偏移，需重新调整光束的空间重叠。
- 通过移动电动载物台并依次采集一系列SRS图像，保存一个高光谱SRS扫描。
注意： 延迟扫描范围覆盖了两个拉曼峰，分别对应于 2,913 cm⁻¹ 和 2,938 cm⁻¹ 的振动模式。-1 和 2,994 cm-1 DMSO 的拉曼峰。当使用 800 nm 泵浦光和 1,040 nm 斯托克斯激光时，可观察到这两个跃迁。 - 使用 ImageJ 或 MATLAB 绘制 DMSO 溶液的 SRS 谱图。对 DMSO 在 2,913 cm⁻¹ 处的强峰进行拟合。-1 使用 MATLAB 对峰进行高斯或洛伦兹函数拟合，以计算该峰的半高全宽（FWHM）。
注意： 代表性结果如图所示 图4如果仅出现一个宽峰，则意味着要么光谱分辨率太低，无法区分两个峰，需要增加玻璃棒数量，要么扫描范围太小而未能检测到第二个峰。通常情况下，可接受的光谱分辨率下DMSO的峰约为20–25 cm⁻¹-1 当玻璃棒长度为 >使用60 cm。组织成像通常采用较低分辨率，以换取更短脉冲带来的更强信号。
- （可选）使用自相关仪或FROG（频率分辨光学开关）测定每条光路的脉冲持续时间，以精确计算所需色散群延迟（GDD）量以及匹配泵浦光与斯托克斯光之间GDD所需的棒材长度。
- 重复步骤 3.3.2–3.3.4，对斯托克斯光束使用不同长度的玻璃棒，以找到最佳光谱分辨率，即通过实验确定最佳群延迟色散（GDD）匹配。使用多组长度不同的玻璃棒，以实现最佳光谱分辨率。
4. 信噪比（SNR）表征
- 确保在完成完全的空间和时间对准后，再执行步骤 4.2。
- 获取对应于 DMSO 的 2,913 cm-1 拉曼峰的 SRS 图像。在 ImageJ 中打开该图像，并在帧中心选择一个小区域。使用 测量 功能计算所选区域内像素值的平均值和标准差。
将所选区域的平均值除以其标准差，以得到信噪比（SNR）值，如公式（2）所示。
注意：当系统在双臂聚焦处使用 40 mW/40 mW 的 DMSO 并设置锁相放大器时间常数为 4 μs 时，良好的 SNR 应 >800。若数据采集卡的位深度有限，可采用更低浓度的 DMSO 或更低的激光功率，以更准确地估计 SNR。
- 如果 SNR 过低，需重新对准激光脉冲，以优化空间重叠、时间重叠、光束尺寸/准直匹配和/或色散匹配。对于带有像差校正环的物镜，可通过调节校正环来优化信号。
5. 频率轴校准
注意：此步骤用于将延迟阶段的位置与扫描的拉曼跃迁关联起来。需要仔细选择溶剂以生成合适的“拉曼标尺”。DMSO 是 C-H 键的有效溶剂，因其在 2,913 cm-1 和 2,994 cm-1 处具有两个尖锐的拉曼峰。
- 保存一个超光谱扫描，其延迟台扫描范围需覆盖 DMSO 的 2,913 cm-1 和 2,994 cm-1 拉曼峰。保存与该超光谱数据集对应的延迟台位置。
注意：光谱的全局最大峰对应于 DMSO 的 2,913 cm-1 拉曼位移，第二强峰对应于 DMSO 的 2,994 cm-1 拉曼位移。 - 对 2,913 cm-1 和 2,994 cm-1 处的延迟台位置与拉曼位移进行线性回归。利用该线性回归方程（描述延迟台位置与拉曼位移的关系），将延迟位置转换为对应的拉曼频率。
6. 正交调控与双色成像
注意：正交调制步骤仅在需要实时双色成像时才必要。该方案的示意图见图5。正交调制使用一对电光调制器（EOM），其驱动频率为激光频率的四分之一（对于80 MHz的激光器为20 MHz），且两者之间具有90°的相位差。对于单色SRS成像或高光谱SRS成像，可跳过此正交调制步骤。
- EOM1 调制
- 在第一个电光调制器（EOM）之后的斯托克斯光束路径中安装一个偏振分束器（PBS2）、一个四分之一波片（QWP2）和第二个电光调制器（EOM2）。断开 EOM2 的信号输入。连接 EOM1 的信号输入并将其开启。
- 通过将光束穿过第一个 EOM，以 20 MHz（f0/4）对固定在 1,040 nm 的斯托克斯光束进行调制。调整 EOM1 的倾斜角度和位置，确保光束垂直且居中地穿过 EOM 晶体。
- 使用两个光电二极管监测从 PBS1 输出的两个偏振态，并在示波器上显示调制信号，以监控调制深度。
- 调整 QWP1、EOM1 电压以及 20 MHz 输入信号的相位（使用移相器），以优化透射光束的调制深度，使其接近 100%。调制深度良好的示意图参见 图 2B。
- EOM2 调制
- 断开 EOM1 的连接，接入 EOM2。
- 将第二个放大器在 20 MHz 下的高压输出信号送入 EOM2。调整 EOM2 的倾斜角度和位置，确保光束垂直且居中地穿过 EOM 晶体。
- 再次使用示波器观察从 PBS2 输出的两个偏振态，监测调制深度。根据需要调整 QWP2、EOM2 电压和移相器，使两个偏振态的调制深度均接近 100%。
- 确保脉冲序列调制相对于第一次调制具有 90° 的相位差。
注意：如果两个泵浦脉冲序列的相位差不是 90°，则两个通道之间将出现串扰问题。 - 通过同时开启并接入 EOM1 和 EOM2，测试调制的正交性。使用示波器监测 PBS2 分离出的两个偏振态。如果第二个 PBS 后的脉冲序列与 图 2C 不符，则需分别重新优化 EOM1 和 EOM2。
- 在 EOM2 下游安装一块 20 mm 的双折射石英晶体（BRC）和一个半波片（HWP）。同时接入两个 EOM，并监测脉冲序列，使其与 图 2D 相符。
注意：对于本实验中使用的啁啾，20 mm 的 BRC 引起的时间延迟对应于 80 cm-1 的拉曼位移。若使用不同的啁啾，则可能需要不同长度的 BRC。
- 校准
- 使用 DMSO 进行系统校准，通过检测锁相放大器 X 和 Y 通道的输出信号（送入数据采集卡的第 2 和第 3 通道）完成。
- 检查锁相放大器上由较快偏振态和较慢偏振态在 2,913 cm-1 峰产生的信号是否接近 90° 的相位差。若不符合，调整 EOM 的对准，直到两个信号接近 90° 的相位差。
- 校准完成后，找到延迟位置，使其中一个正交光束探测蛋白质在 2,930 cm-1 的跃迁。确保另一偏振态探测脂质在 2,850 cm-1 的跃迁。
7. 反射模式SRS成像
注意：在透射模式成像方案中，物镜将激光聚焦到样品中，然后由聚光镜将透射光束引导至光电二极管进行锁相检测。在倒置（epi）模式成像方案中，由样品背向散射并去偏振的光被聚焦物镜重新收集，并通过偏振分束器进行分离。分离后的背向散射光子经由一对中继透镜传输至光电二极管，进行锁相检测。图6展示了倒置（epi）模式成像方案。
- 在光束进入显微镜之前安装一个HWP，以改变进入显微镜的光束偏振态。在物镜上方放置一个PBS，使去偏振的背向反射光束能够到达探测器。
- 使用一对透镜，包括一个75 mm消色差透镜和一个30 mm非球面透镜，将从物镜后孔径出射的背向散射光子中继至光电探测器。安装探测器以收集由PBS引导的背向散射光。安装滤光片以阻止调制光束进入探测器。
- 将组织样本置于物镜下方。由于反射模式成像不需要聚光镜，若需要更多空间，可将其移除。
- 成像
- 用快门遮挡光束；从侧面将白光光源照射到样本上；使用明场模式确定物镜的焦点。
- 打开两个光束，利用预校准的延迟位置，从锁相放大器的两个输出端获取组织的脂质和蛋白质SRS图像。
- 调节锁相放大器的增益和像素合并因子，以获取高质量图像。
8. 假彩色染色
- 使用 ImageJ 打开图像堆栈。
- 右键单击图像，选择 复制（Duplicate），提取出分别对应脂质（2,850 cm-1）和蛋白质（2,930 cm-1）的两张图像。
- 将脂质图像重命名为 lipids，将蛋白质图像重命名为 proteins。
- 进入 Process | Image Calculator，执行 proteins 减去 lipids 的操作。
- 进入 Image | Color | Merge Channels 合并图像，将 lipids 设置为 绿色（green），将 proteins 设置为 蓝色（blue）。打开 图像通道（image channels） 工具（Image | Color | Channels Tool），并调整亮度和对比度（Image | Adjust | Brightness/Contrast）。
- 使用 通道（channels） 工具分别调整每个通道的亮度和对比度。对于脂质通道，调整对比度直至细胞结构呈现深色；对于蛋白质通道，调整对比度直至细胞结构呈现蓝色。通过进入 Image | Type | RGB Color，将合并后的绿/蓝通道图像转换为 RGB 图像。通过 File | Save As | Tiff 导出该图像。
注意：在伪 H&E 染色中，颜色方案显示细胞质为粉红色，细胞核为深蓝紫色。 - 从 材料表 中的伪 H&E 染色脚本资源下载 HE.m MATLAB 脚本。
- 在 MATLAB 中运行 HE.m 脚本。选择上一步导出的 RGB 图像，以生成人工 H&E 染色图像。
- （可选）对大视野成像进行图像强度归一化，因为图像边缘区域比中心区域更暗。
- 为执行图像场归一化，尽可能多地对图像取平均值，然后使用 ImageJ 去除强度特征（Process | Filters | Gaussian Blur | Radius=50）。
- 测量模糊图像的最大强度（Ctrl+M）。将模糊图像除以其最大强度（Process | Math | Divide）。再将原始 SRS 图像除以该模糊图像（Process | Image | Calculator）。
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结果
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 消色差透镜 | |||
| 20 MHz 带通滤波器 | |||
| 200 mm 消色差透镜 | |||
| 消色差半波片 | |||
| 消色差四分之一波片 | |||
| 光束采样器 | |||
| 二向色镜 | |||
| DMSO（二甲基亚砜） | |||
| 电光幅度调制器 | |||
| 伪 H&E 染色脚本 | |||
| 扇出缓冲器 | |||
| 快速光电二极管 | |||
| 频率分频器 | |||
| 高色散玻璃棒 | |||
| Insight DS+ | |||
| 锁相放大器 | |||
| 反射镜 | |||
| 电动延迟台 | |||
| 油浸式聚光镜 | |||
| 示波器 | |||
| 相位调制器 | |||
| 光电二极管 | |||
| 偏振分束器 | |||
| 折射率数据库 | |||
| 后向反射器 | |||
| 射频功率放大器 | |||
| 扫描反射镜 | |||
| Scan Mirrors | |||
| 短通滤波器 | |||
| 直立显微镜 | |||
| 水浸物镜 |
