透明化小鼠海马组织中星形胶质细胞与兴奋性神经元的双光子显微成像

摘要

来源： Refaeli, R., 等，星形胶质细胞与神经元在透明化脑组织中空间相互作用的研究。 J. Vis. Exp. (2022)

该视频展示了利用双光子显微镜对透明化的小鼠海马组织进行神经成像的实验过程，包括成像腔室的制备，以观察荧光标记的星形胶质细胞与兴奋性神经元之间的空间相互作用。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 反应室准备

注意： 每个样本都需要一个带有成像腔室的载玻片，样本将被放置于该腔室内。

1. 将样品置于载玻片中央。
2. 使用热熔胶枪在载玻片边缘构建围壁，高度接近组织。确保在其中一个角落留出一个小间隙（约 5 mm）（图 1A, B）。
3. 在样品上滴加 1–2 滴折射率匹配溶液（RIMS），以保持盖玻片与组织之间上表面湿润，并防止气泡形成。
4. 滴加折射率匹配溶液（RIMS）后，立即在围壁上再添加一层热熔胶（使其达到脑组织/切片的高度），并在热熔胶仍处于液态时立即进入步骤 1.5。
5. 用盖玻片密封顶部，将其尽可能均匀地放置在仍温热的热熔胶层上（图 1C）。
6. 通过热熔胶围壁预留的间隙将 RIMS 注入腔室中（图 1D, E）。
7. 用热熔胶封闭间隙，确保内部无空气残留（图 1F）。
8. 若热熔胶围壁超出载玻片边缘，需剪除多余部分（图 1G）。
9. 若成像所用物镜为浸没式，需在盖玻片上方的围壁上再添加 2–3 mm 高的热熔胶，以延长浸没液的使用时间（图 1H）。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC 载体核心设施 (EVCF)		用于检测星形胶质细胞的病毒载体
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC 载体核心设施 (EVCF)		用于检测神经元的病毒载体
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC 载体核心设施 (EVCF)		用于检测神经元细胞核的病毒载体
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC 载体核心设施 (EVCF)		用于检测神经元的病毒载体
Imaris 软件	Bitplane，英国		一种可实现图像三维分析的软件
RapiClear	SunJin 实验室	#RC147002
RapiClear CS	SunJin 实验室	#RCCS002
SyGlass 软件			一种利用虚拟现实技术实现图像三维分析的软件
双光子显微镜	Neurolabware		钛宝石激光器（Chameleon Discovery TPC，Coherent），GaAsP 光电倍增管（Hamamatsu，H10770-40），带通滤光片（Semrock），水浸 16 倍物镜（Nikon，0.8 NA）
VA-044 引发剂	Wako	#011-19365