可视化小脑颗粒神经元在不同发育阶段的突触形成

摘要

来源： Chan, U., et al., 利用体内出生后电穿孔研究小脑颗粒神经元形态与突触发育。 J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了通过成像标记了荧光蛋白的小鼠脑组织切片，利用共聚焦显微镜采集高分辨率z轴层扫图像，并测量包括神经突长度、树突爪形成、表面积和体积在内的结构参数，以研究小脑颗粒神经元发育及突触形成过程。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 小脑颗粒神经元（CGNs）的形态学分析——三维（3D）重建及表面积与细胞体积

1. 使用共聚焦显微镜，以63倍物镜和2倍缩放倍数对单个电穿孔的小脑颗粒神经元（CGNs）进行成像，每个层面以0.5 µm的间隔采集z轴堆栈图像。每个图像窗口中仅包含一个细胞，以便于后续的图像分析与重建。
2. 通过以下链接（https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions）为FIJI安装Simple Neurite Tracer插件，以在三维（3D）空间中高效且便捷地追踪电穿孔小脑颗粒神经元（CGNs）的结构。

注意： 该插件已有更新版本（https://imagej.net/SNT）。

3. 使用 Simple Neurite Tracer 以盲法分析神经突长度和树突爪状结构的形成。将电转染的小脑颗粒神经元（CGNs）单通道 z 轴层析图像上传至 FIJI 软件，点击 Plugins | Segmentation | Simple Neurite Tracer（图 1D）。
4. 打开下拉菜单，选择 Create New 3D Viewer（图 1D）。
5. 滚动至树突基部，即其与胞体连接处，点击连接点以开始建立路径。通过在细胞填充信号最亮的切片区域逐次点击，手动追踪路径，并按 [y] 键以继续追踪。若树突无爪状结构，则追踪至树突末端；若有爪状结构，则追踪至爪状结构基部，并按 [f] 键确认路径（图 2D）。
6. 接下来，从爪状结构基部开始新建路径，追踪至最长神经突的末端以完成对爪状结构的追踪。通过在 Windows 系统中按住 [ctrl] 键或在 Mac OS 系统中按住 [alt] 键并点击路径，可追踪二级和三级分支。按 [f] 键确认路径。
7. 注意观察，追踪的测量数据将在另一个窗口中显示；将爪状结构各分支（一级、二级、三级）的所有测量值相加，得到每个爪状结构的总长度。
8. 为分析电转染 CGNs 的表面积和细胞体积，请下载 Imaris 细胞分析软件（https://imaris.oxinst.com/）。

注意：FIJI 也可以利用现成的免费插件，通过 z 轴层析图像（z-stack images）对细胞进行三维重建。此外，Simple Neurite Tracer 具备体积渲染功能，但本文采用 Imaris 的原因如以下所述。

9. 将电穿孔转染的小脑颗粒神经元（CGN）的z轴层扫图像上传至Imaris软件。通过点击Surpass进入三维重建工具包。
10. 为重建CGN，点击Surfaces，然后在图像窗口中选择一个包含完整细胞的感兴趣区域。完成后，点击下方右下角的蓝色前进箭头（Create模块下）。
11. 如果图像包含多个不同信号的通道，请选择包含电穿孔转染CGN的通道，然后点击蓝色前进箭头。
12. 利用侧边栏设置一个能够最准确拟合电穿孔细胞信号的阈值。放大细胞表面以更精确地确定阈值。完成后，点击双绿色箭头以重建细胞，并从元数据中获取表面积和体积大小。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Imaris	Bitplane
蔡司780直立共聚焦显微镜	Zeiss	780