可视化不同发育阶段小脑颗粒神经元的突触发生

摘要

来源： 陈氏，美国，{{}}等人，{{}} 利用体内出生后电穿孔研究小脑颗粒神经元形态和突触发育。J. 对比实验 {{}}（2021 年）。

本视频演示了通过对荧光蛋白标记的小鼠的预先固定的脑组织切片进行成像，使用共聚焦显微镜捕获高分辨率 z 堆栈图像，并测量结构参数（包括神经突长度、树突状爪形成、表面积和体积）来分析小脑颗粒神经元的发育，以研究突触发生。

方案

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 小脑颗粒神经元或 CGN 的形态学分析 - 三维 （3D） 重建和表面积和细胞体积

1. 在共聚焦显微镜上以 63 倍物镜和 2 倍变焦对单个电穿孔 CGN 进行成像，以每叠 0.5 μm 的 z 轴序列图像拍摄。每个图像窗口对一个细胞进行成像，以便于图像分析和重建。
2. 使用以下链接 （https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions） 安装适用于 FIJI 的 Simple Neurite Tracer 插件，以轻松有效地在三维 （3D） 空间中跟踪电穿孔 CGN 的结构。

注意： 插件有更新版本 （https://imagej.net/SNT）。

3. 使用 Simple Neurite Tracer 以盲法分析神经突长度和树突爪的形成。将电穿孔 CGN 的单通道 z 堆栈图像上传到 FIJI，然后单击插件 |细分 |简单神经突示踪剂 （图 1D）。
4. 访问下拉菜单，然后选择创建新的3D查看器（图1D）。
5. 滚动到树突的底部，在那里它与细胞体相连，然后单击交汇点开始一条路径。通过单击单元格填充信号最亮的部分来手动跟踪路径，按 [y] 保留跟踪。如果树突不包含爪子，则追踪到树突的末端，或者直到爪子的底部，然后按[f]确认路径（图2D）。
6. 接下来，通过在结构底部开始一条路径并追踪直到最长的神经突的末端来追踪爪子。通过在 Windows 上按住 [ctrl] 或在 Mac OS 上按住 [alt] 并单击路径来跟踪二级和三级分支。按 [f] 确认路径。
7. 请注意，迹线的测量值在单独的窗口中可见;将爪分支（初级、次级、三级）的所有测量值相加，得到每个爪的总长度。
8. 要分析电穿孔 CGN 的表面积和细胞体积，请下载 Imaris 细胞分析软件 （https://imaris.oxinst.com/）。

注意：FIJI 还可用于使用现成的免费插件从 z 堆栈图像重建 3D 细胞。此外，Simple Neurite Tracer 具有体积渲染功能，但使用 Imaris 的原因如下所述。

9. 将电穿孔 CGN 的 z 堆栈图像上传到 Imaris。按 Surpass 访问 3D 重建工具包。
10. 要重建 CGN，请按 Surfaces，然后选择一个感兴趣的区域，该区域包含图像窗口中的整个单元格。完成后，按右下角的蓝色前进箭头 创建.
11. 如果图像包含不同信号的多个通道，请选择包含电穿孔 CGN 的通道，然后按蓝色前进箭头。
12. 使用侧边栏，设置最准确拟合电穿孔池信号的所需阈值。放大到更靠近单元格表面的位置，以准确确定阈值。完成后，按双绿色箭头重建单元格并从元数据中获取表面积和卷大小。

结果

材料