清醒小鼠小胶质细胞动力学和神经元活动的同时成像

摘要

来源：丸冈，H.，等。al. 清醒小鼠的小胶质细胞动力学和神经元活动的同时成像。J. 对比实验 （2022）

该视频展示了一种双光子显微镜程序，用于对清醒小鼠在视觉刺激过程中的神经元活动和小胶质细胞动力学进行成像，突出钙瞬变和细胞相互作用。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

小胶质细胞和神经元钙动力学的体内双光子成像

1.小鼠对显微镜装置的习惯

1. 性手术后 3 周，用 3% 异氟醚在小鼠中诱导麻醉，并使用定制的立体定位仪器将小鼠置于双光子显微镜的 25 倍物镜下（图 1C）。对于设置，鼠标被设置在跑步机的顶部，并允许自由运行。
2. 大约 10 分钟后，将鼠标从显微镜载物台中取出，并将其放回家笼中。在双光子图像采集之前，每隔一天至少重复 3 次习惯化。

2. 双光子图像采集

注意：我们建议在手术后 4 周以上进行图像采集，因为小胶质细胞活化会逐渐恢复到基础水平。

1. 用 3% 异氟醚在小鼠中诱导麻醉，并使用定制的立体定位仪器将小鼠置于双光子显微镜的物镜下。
2. 如下所述，安装定制的遮光装置（图 1A 和图 1B）和用于视觉刺激的 LCD 监视器（图 1D）。<>定位
3. 镜头以聚焦在大脑表面，然后将此镜头位置设置为原始 Z 位置。保持 x-y 坐标不变并升高物镜;从物镜和跑步机上取下鼠标和立体定位仪器。
4. 使用硅胶在头板顶部安装遮光装置，硅胶与木炭粉混合发黑，并确保头板与遮光装置之间的空间密封良好。
5. 用蒸馏水填充遮光装置，然后再次将鼠标和立体定位框架固定在物镜下方和跑步机上。小心地重置大脑表面的焦平面，检查物镜的深度。
   注意：为避免损坏物镜的风险，请先设置 xyz 坐标，然后应用物镜的遮光装置。先安装盖子，然后再调整坐标也是合理的，但此选项需要谨慎处理。
6. 用黑色铝箔覆盖物镜，以避免来自用于通过物镜进行视觉刺激的 LCD 监视器的光污染（图 1D）。将 10 英寸 LCD 显示器设置在鼠标眼前 12.5 厘米处，以呈现视觉刺激（图 1D）。

将荧光发射收集滤光片配置为 EGFP 荧光（525/50 nm 发射滤光片）和 R-CaMP 荧光（593/46 nm 发射滤光片），激发波长为 1,000 nm。使用 25x 1.1 NA 物镜和 GaAsP PMT 以 0.25 μm/像素的空间分辨率采集图像。

找到 R-CaMP （+） 神经元和 EGFP （+） 小胶质细胞可以在第 2/3 层同时成像的成像区域。对于这种设置，图 2 中获得的数据位于距软脑膜表面 100 μm 的深度处，使用实时图像预览。保持激发激光器的功率尽可能低，以避免成像区域局部温度升高引起的光漂白和损坏。

以 30 Hz 的帧速率采集图像。在图像采集的同时，以 100% 对比度、1.5 Hz、0.04 个周期/度在 12 个方向上以 0° 到 150° 的 6 个方向以 30° 的步长向鼠标呈现漂移光栅视觉刺激。

图像采集后，将鼠标从显微镜载物台上取下，从鼠标上拆下遮光装置和立体定位仪，然后将鼠标放回其家笼中。

结果

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材料