在清醒小鼠中同步成像小胶质细胞动态与神经元活动

摘要

来源： Maruoka, H., et. al. 清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种双光子显微成像技术，用于在视觉刺激过程中对清醒小鼠的神经元活动和小胶质细胞动态进行成像，重点呈现钙瞬变及细胞间相互作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

小胶质细胞与神经元钙动力学的活体双光子成像

1. 小鼠对显微镜装置的适应

1. 手术后三周，使用 3% 异氟烷对小鼠进行麻醉诱导，并利用定制的立体定位仪将小鼠置于双光子显微镜的 25 倍物镜下（图 1C）。在装置设置中，将小鼠放置于跑步机上方，使其能够自由奔跑。
2. 约 10 分钟后，将小鼠从显微镜载物台上取下并放回饲养笼中。在进行双光子成像采集前，每隔一天至少重复训练 3 次。

2. 双光子图像采集

注意：我们建议在手术后超过4周再进行图像采集，因为小胶质细胞的激活会逐渐恢复至基础水平。

1. 使用3%异氟烷对小鼠进行麻醉，并利用定制的立体定位仪将小鼠固定在双光子显微镜的物镜下方。
2. 安装定制的遮光装置（图1A 和 图1B）以及用于视觉刺激的液晶显示器，如下所述（图1D）。
   1. 调整物镜位置，使其聚焦于脑表面，然后将此位置设为初始Z轴位置。保持X-Y坐标不变，抬升物镜；将小鼠及立体定位仪从物镜和跑步机上取下。
   2. 使用混有炭黑粉末而呈黑色的硅胶将遮光装置固定在头板顶部，并确保头板与遮光装置之间的空间密封良好。
   3. 向遮光装置内注入蒸馏水，然后再次将小鼠及其立体定位框架固定在物镜下方和跑步机上。仔细重新设定聚焦平面至脑表面，并检查物镜的深度。
      注意： 为避免损坏物镜，应先设定XYZ坐标，再安装物镜遮光装置。也可先安装盖板再调整坐标，但此操作需格外谨慎。
   4. 用黑色铝箔覆盖物镜，以防止用于视觉刺激的液晶显示器发出的光线通过物镜进入系统造成光污染（图1D）。在小鼠眼睛前方12.5 cm处放置一个10英寸的液晶显示器，用于呈现视觉刺激（图1D）。
3. 设置荧光发射收集滤光片以检测EGFP荧光（525/50 nm发射滤光片）和R-CaMP荧光（593/46 nm发射滤光片），激发波长设为1,000 nm。使用25倍、数值孔径1.1的物镜和GaAsP PMT探测器，以0.25 μm/像素的空间分辨率采集图像。
4. 在第2/3层中寻找可同时成像R-CaMP（+）神经元和EGFP（+）小胶质细胞的成像区域。本实验设置中，图2 所示数据采集于软脑膜表面下100 μm深度处，使用实时成像预览功能确定位置。激发激光功率应尽可能调低，以避免光漂白以及因成像区域局部温度升高造成的组织损伤。
5. 以30 Hz的帧率采集图像。在图像采集的同时，向小鼠呈现漂移光栅视觉刺激，对比度为100%，频率为1.5 Hz，空间频率为0.04 cycles/度，共6个方向（从0°到150°，每隔30°一个方向），每个方向呈现12次。
6. 图像采集完成后，将小鼠从显微镜载物台上取下，拆除其头部的遮光装置和立体定位仪，并将小鼠放回饲养笼中。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10英寸液晶显示器	EIZO	DuraVision FDX1003	用于呈现光栅视觉刺激
黑色铝箔	THORLABS	BKF12
CX3CR1-EGFP 小鼠	杰克逊实验室	IMSR_JAX: 005582	CX3CR-1EGFP/+ 基因敲入/敲除 小胶质细胞中表达EGFP的小鼠 在大脑中受……控制 内源性 Cx3cr1 基因座
DENT 硅胶-V	Shofu Inc	N/A	用于遮光装置的安装 将设备连接至头板
头板	定制化	N/A	材料：SUS304，厚度：0.5 mm
异氟烷	辉瑞	N/A
多光子激发显微镜	NIKON	N/A	商品名为“A1MP+”
物镜	尼康	N/A	商品名为“CFI75 apochromat 25xC W”。
Psychtoolbox		免费软件	用于呈现光栅视觉刺激
遮光装置	定制化	N/A
立体定位仪	定制化	N/A	用于在双光子显微镜下固定小鼠 显微镜
跑步机	定制化	N/A