使用光学分馏器技术定量大鼠脑组织中新生成的神经元

Abstract

来源： Olesen， M. V.， {{}}et al.光学分馏器技术，用于估计电休克疗法大鼠模型中的细胞数量。J. Vis. Exp. （2017）.

该视频演示了量化脑组织中新生成的神经元的技术。使用免疫组织化学对含有溴脱氧尿嘧啶 （BrdU） 标记神经元的海马组织切片进行染色，然后使用光学分级分离器技术对整个组织厚度进行定量。

Protocol

所有涉及动物样本的程序都已经过适当的动物伦理审查委员会的审查和批准。

1.组织处理

注意： 经心脏灌注和后固定后，在4°C下在0.2M磷酸盐缓冲液中稀释的4%多聚甲醛（PFA）中过夜后，将大脑转移到磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的30%蔗糖中，在4°C下转移三天。之后，将大脑冷冻在干冰粉上并储存在 -80 °C 直至切片。

1. 使用手术刀沿大脑的中线分离左右半球。然后，在第一个大脑中随机选择一个或另一个半球。之后，在左右半球之间系统地切换 （图 1A图 1B）。
   1. 将所有采样切片连续放入冷却的多盘容器中，以保持切片按切割顺序排列。
   2. 2. 免疫染色

      注意：为了在整个染色过程中跟踪各个切片，请将采样切片放入 25 孔染色网中。每 5 个切片使用一次，每个海马体的平均最终数量为 12 （8-16） 个切片，用于免疫染色和随后的细胞计数。

      1. 在每 n 个部分进行一次子采样之前，在第 1 部分和 n 部分之间随机开始（），将容器从 -20 °C 转移到室温 （RT）。
      2. 注意：₂O₂） 在蒸馏水中稀释 （dH₂O） 20 分钟。
      4. ₂O₂ 10 分钟。
      5. ₂₂O 15分钟。
      6. 3. 使用光学分馏器估计 BrdU 标记的神经元总数

         注意：进行一项包括一些动物的试点研究，以确定最佳采样参数，例如要分析的切片数量和采样切片内的光学解剖器数量。该试点还提供了初步的 CV（标准差/平均值）以及调整 CE 以获得研究者确定的估计值令人满意的精度的可能性（有关更多详细信息，请参见下文）。同样，z 分布分析将解决以下几点：组织收缩、整个切片的染色质量以及 z 轴上细胞的分布。

         1. 检查切片中组织的厚度，以确认它们适合光学分离器使用，例如，对于所选剖切器的高度（包括保护区）来说足够厚（见下文）。 注意： 在感兴趣区域内的几个地方测量组织厚度。
            1. 将载玻片放在显微镜的电动载物台上，并打开首选的立体软件。
            2. 图 2A例如，图 2B）。
            3. 图 2B）。
         2. 注意：
         3. 对 BrdU 标记的神经元进行采样，并记录它们的 z 位置以及在每个计数帧的选定角中测量的局部切片厚度。
         4. 注意：
         5. 在所有要分析的部分上划定感兴趣区域并注册区域。
         6. 注意：_step）。
         7. _step，它将提供 x-y 步长。
      8. 注意：注意：图 2B）。当被解剖器高度内感兴趣的特征清楚地识别时，不要计算接触排除线的 BrdU 阳性神经元。在整个立体定量过程中仔细遵循这些计数规则至关重要。
         注意：

Results

Materials