活体成像的 果蝇 使用荧光显微镜观察蛹眼

摘要

来源： Hellerman, M. B., 等 活体成像 果蝇 蛹期复眼 视频实验杂志 (2015)

该视频展示了一种用于研究黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）蛹期眼睛图式形成的活体成像技术。通过绿色荧光蛋白（GFP）标记的示踪剂，可实现对发育中眼结构形成过程中细胞组织结构与分化过程的可视化观察。

方案

1. 荧光成像

1. 使用荧光显微镜对Drosophila蛹期样本进行成像。每隔 7 分钟，在黏附连接区域对眼神经上皮的顶区连续采集光学切片。
   注意：a) 合适的连续光学切片通常每个 z 层叠包含 4–5 层，z 轴步长为 0.2 μm。b) 上皮组织拓扑结构可能存在不规则性，包括轻微隆起和折叠，这可能使大范围组织区域难以获得清晰对焦的图像。在成像过程中，可能会出现感兴趣区域的一部分清晰对焦，而邻近区域失焦的情况。在蛹眼与盖玻片之间加入少量蒸馏水可消除部分急性组织折叠，但无法消除蛹眼形态发生早期阶段所特有的轻微不平整拓扑结构。在此类情况下，可通过扩展 z 层叠范围以对组织进行过采样，直至整个视野的所有区域均获得清晰对焦的切片。c) 每隔 7 分钟采集一次连续切片，可在不显著降低绿色荧光蛋白（GFP）荧光强度的情况下实现 3 至 4 小时的活体成像，从而避免影响图像质量。更短的时间间隔可能会缩短总成像时长。
2. 持续成像 3 至 4 小时。请勿使用许多荧光显微镜配备的自动对焦和定时功能，因为蛹体生长及血淋巴泵动会导致视网膜位置移动，因此需每隔 14–21 分钟手动重新对焦。

注意： 超过 4 小时的成像可能会减缓或阻碍眼睛的形态发生。

3. 使用适当的去卷积软件以降低背景噪声并增强连续切片图像的对比度。对于每个z轴堆栈文件，在Leica高级荧光应用套件（LAS AF）软件中执行以下操作：进入工具面板，选择3D去卷积，然后点击应用。
4. 为每个去卷积后的堆栈文件生成最大强度投影（MP）图像：进入工具面板，选择3D投影，然后点击应用。
   注意：对于过度采样的组织，最大强度投影（MP）算法可能无法生成全幅清晰聚焦的图像。

2. 图像处理

1. 自动图像对齐：

注意： 在成像过程中，活体 Drosophila 组织会发生位移并持续生长。因此，在不同时间点采集的图像中心可能并不对应于 Drosophila 组织中的同一位置。此外，在蛹形成后约 21 至 23 小时之间，整个视网膜盘会旋转约 30°。为了突出单个细胞的行为并减少由生物体生长带来的干扰，应对每幅多光子（MP）图像进行对齐。虽然该过程可手动完成，但此处使用的图像编辑软件内置了可加速此流程的算法。

2. 从主菜单的“文件”选项卡中，打开“脚本”并选择“将文件加载为图层堆栈”。
3. 将MP图像文件导入“加载图层”面板，然后选择“确定”。请确保未自动选中“尝试对齐源图像”选项。
4. 注意： 如果选中此选项，软件可能会使用导致图像数据失真的对齐算法。
5. 当所有MP文件均已加载至图层窗格后，请确认所有图像按时间顺序排列，最早的时间点位于图层堆栈的顶部。若图层顺序不正确，请通过拖放操作调整至正确顺序。
6. 从主菜单的“编辑”选项卡中选择“自动对齐图层”，选择“重新定位”，然后点击“确定”。
7. 如果自动对齐算法未能将各帧对准相关焦点，可使用“移动”工具进行微调。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b
25 x 75 x 1 mm 玻璃载玻片	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm 玻璃盖玻片	VWR	48393-172
镊子	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3 mm 层析纸	Fisher Scientific	05-713-336
凡士林	Fisher Scientific	19-086-291
30 ml 注射器	Fisher Scientific	S7510-30
Adobe Photoshop CS5	Adobe
Leica TCS SP5 DM 显微镜	Leica Microsystems
LAS AF 版本 2.6.0.7266 显微镜软件	Leica Microsystems