使用荧光显微镜对果蝇 Pupal 眼进行实时成像

1. 荧光成像

1. 果蝇蛹制剂使用荧光显微镜成像。每 7 分钟通过眼神经上皮的顶端域，在粘附连接区域捕获连续切片。
   注： a） 适当的序列截面通常为每个 z 堆栈 4-5 个，由 0.2 μm z 步长组成。b） 上皮拓扑结构的不规则性，包括轻微的凸起和褶皱，可能使获取大面积组织聚焦图像变得具有挑战性。在成像时，人们可能会发现感兴趣区域的一部分是焦点，而邻近区域的一部分是失焦的。在蛹眼和盖玻片之间加入一小滴蒸馏水可以消除一些急性组织褶皱，但不能消除蛹眼形态发生早期阶段的轻微不均匀拓扑特征。在这些情况下，通过扩展 z 堆栈对组织进行过采样，直到为整个视野获取聚焦切片。c） 每 7 分钟采集一次连续切片应能够进行 3 至 4 小时的实时成像，而不会显著降低可能影响图像质量的绿色荧光蛋白 （GFP） 荧光强度。较短的时间间隔可能会减少成像的总时间。
2. 继续成像 3 至 4 小时。不要使用许多荧光显微镜上提供的自动对焦和时间功能，因为蛹的生长和血淋巴的泵送会移动视网膜的位置，并且需要每 14-21 分钟警惕地重新聚焦一次。

注意：超过 4 小时的成像可能会减慢或阻碍眼睛的形态发生。

3. 使用适当的反卷积软件来减少背景并增强序列截面图像的对比度。对于每个 z 堆栈文件，在 Leica 应用程序套件高级荧光 （LAS AF） 软件中执行以下作：导航到"工具"面板，选择"3D 反卷积"，然后单击"应用"。
4. 为每个去卷积堆栈文件生成最大投影 （MP） 图像：导航到"工具"面板，选择"3D 投影"，然后单击"应用"。
   注： MP算法可能无法为过采样的组织生成均匀聚焦的图像。

2.图像处理

1. 自动图像对齐：

注： 活的果蝇组织在整个成像过程中会移动和生长。因此，在连续时间点收集的图像中心可能与果蝇组织中的同一点不对应。此外，在蛹形成 （APF） 后 ~21 至 23 小时之间，整个视网膜盘旋转约 30°。为了突出单个细胞的行为并减少生物体生长引起的干扰，请对齐每个 MP 图像。虽然这可以手动执行，但此处使用的图像编辑软件具有可以加快该过程的内置算法。

2. 从主菜单的 File 选项卡中，打开 Scripts 并选择 Load Files into Stack。
3. 将 MP 图像文件导入 Load Layers 面板，然后选择 OK。确保 Attempt to Align Source Images 选项未自动选中。
4. 注： 如果选择此选项，软件可能会使用使图像数据失真的对齐算法。
5. 将所有 MP 文件加载到 Layers 窗格中后，请确保所有图像都按时间顺序排列，以便最早的时间点位于图层堆栈的顶部。如果图层的顺序不正确，请拖放它们，直到它们的顺序正确为止。
6. 从主菜单的 Edit 选项卡中选择 Auto-Align Layers。选择"重新定位"并单击"确定"。
7. 如果"自动对齐"算法无法将框架定向到相关的焦点，请使用"移动"工具进行细微调整。