活体小鼠海马中荧光标记神经元的纵向双光子成像

摘要

来源： Ulivi, A. F., et. al. 活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像. J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了在活体小鼠中对荧光标记的锥体神经元进行纵向双光子成像，演示了用于研究海马CA1区神经元结构的制备、导管对准以及树突和树突棘的成像过程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会审核。

1. 成像前准备
2. 提前开启成像设备，必要时让激光器预热并稳定。
3. 对小鼠进行麻醉。将小鼠放入麻醉诱导舱中，使用浓度为3%的异氟烷（O₂流速为1 L/min），直至其失去意识。通过脚趾夹捏反射测试评估麻醉深度。
4. 使用镊子小心地从头部固定板上移除粘附膜。一手握住小鼠，另一手用手指固定头部固定板。轻柔地移除薄膜，避免损伤制备区域。
5. 将小鼠置于显微镜下，放置在加热垫上，并将头部固定板牢固安装至固定装置（图1D）。
6. 调整鼻罩以覆盖小鼠口鼻部，并将异氟烷浓度降低至1.5–2%。
7. 将眼用软膏涂抹于小鼠眼睛表面。
8. 用去离子水冲洗成像套管以清洁其内部。使用注射器和细针向套管内滴加去离子水，并用真空泵将其抽出。

2. 成像过程

1. 使用低倍率、长工作距离的物镜，目视检查套管中是否存在残留水分、污物、结构完整性以及荧光信号。
2. 通过调节头部固定装置臂的角度，将套管与光轴对齐。
3. 切换至 25X 1.0 NA（数值孔径）、4 mm WD（工作距离）或 40X 0.8 NA、3 mm WD 的水浸物镜。加入足够的去离子水以充满套管，并在套管顶部保持过量的水，避免产生气泡。
4. 采用双光子（2P）激发，采集荧光信号。
   注意：成像方案高度依赖于所要观察的时间和空间尺度。有关本文所用图像的成像参数设置，请参见结果与讨论部分的代表性示例。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不锈钢管 Ø 3.0 × 0.25 mm（内径） Ø 2.5 mm）L = 500 mm	Sawade	R00303	用于套管金属环的不锈钢管
显微镜盖玻片（4 mm 圆形）	恩格尔布雷希特医疗与实验室技术		用于套管玻璃的盖玻片
异氟烷 CP，安瓿 250 ml	Henry Schein VET GmbH	798932	用于麻醉的液态异氟烷
哈佛仪器异氟烷漏斗加注式蒸发器	哈佛仪器有限公司	34-1040	异氟烷蒸发器
实验室主动式废气吸收装置	Gropper Medizintechnik	UV17014	异氟烷回收系统
CMA 450 温度控制器	Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH	8003770	加热垫
Bepanthen眼鼻软膏	拜耳股份公司		眼用软膏
头固定板	定制制作		30 mm × 10 mm 尺寸；8 mm 直径孔，钛材质
头部固定板夹	定制制作		头部固定板支架
立柱式支架	Thorlabs	PH20E/M	头固定板支架
不锈钢柱	Thorlabs	TR30/M	头固定板支架
不锈钢柱	Thorlabs	TR75/M	头部固定板支架
不锈钢柱	Thorlabs	TR150/M	头固定板支架
后连接器夹	定制制作		头部固定板支架
铝制光学平台，300 mm × 450 mm × 12.7 mm，M6 螺纹孔	Thorlabs	MB3045/M	显微镜载物台
7英寸 x 4英寸 实验用升降台	Thorlabs	L490/M	显微镜载物台
低剖面面罩，适用于小型小鼠	Emka Technologies	VetFlo-0801	麻醉面罩支架
功率计型号 1918-R	纽波特		功率计
X-Cite 120Q	Excelitas Technologies		荧光灯
双光子显微镜	Bruker	Ultima IV	双光子显微镜
双光子显微镜	Thorlabs	贝加莫	双光子显微镜
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22	奥林巴斯		目标
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22	奥林巴斯		目标
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5	奥林巴斯		目标
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18	奥林巴斯		目标
用于双光子激发的超快可调谐激光器	Spectraphysics	Mai Tai Deep See	激发激光器
用于双光子激发的超快可调谐激光器	Spectraphysics	InSight DS+ 双束激光器	激发激光器
用于三光子激发的超快可调谐激光器	相干	Monaco	激发激光器