活体小鼠海马体中荧光标记神经元的纵向双光子成像

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 准备成像过程
2. 提前打开成像设置，必要时让激光器预热和稳定。
3. 麻醉鼠标。将小鼠置于麻醉诱导室中，以 3% 异氟醚以 1 L/min O₂ 并等待直到它失去意识。使用脚趾捏反射试验评估麻醉情况。
4. 使用镊子小心地从头架板上取下粘合膜。用手握住鼠标，用手指握住头架板。轻轻撕下薄膜，以免损坏制剂。
5. 将鼠标放在显微镜下，放在加热地毯上，并将头板固定在支架上（图1D）。
6. 放置鼻锥以覆盖鼻子并将异氟醚降低到 1.5-2%。
7. 将眼药膏涂抹在小鼠的眼睛上。
8. 用去离子水冲洗成像套管，清洁成像套管。使用注射器和细针将水滴入套管中，然后用真空泵将其取出。

2. 成像

1. 使用低倍率和长工作距离物镜目视检查套管是否有残留水、污垢、完整性和荧光。
2. 通过调整头架臂的角度，将套管与光轴对齐。
3. 切换到 25X 1.0 NA（数值孔径）、4 mm WD（工作距离）或 40X 0.8 NA、3 mm WD 水浸物镜。加入足够的去离子水以填充套管并保持套管顶部多余的水。避免形成气泡。
4. 使用双光子 （2P） 激发和成像荧光信号。
   注：成像协议高度依赖于要成像的时间和空间尺度。请参阅该部分的代表性结果和讨论，了解有关我们用于生成本文所示图像的成像设置的详细信息。

图 1：体内深部脑光学成像的准备工作。（A）。成像套管示例的顶视图（左）和侧视图（右）。成像插管具有透明的玻璃底部，允许从光学角度进入海马体。（B）。制备的示意图描述突出显示了成像套管、CA1 PN（锥体神经元）和从背侧到腹侧的三层纤维的相对位置。（C， D）。成像过程中成像装置 （C） 和动物固定 （D） 的示意图描述。