使用荧光显微镜研究硬脑膜感觉神经元的起源

摘要

来源： Wang, J., et al．利用免疫荧光与神经示踪技术可视化大鼠颅部硬脑膜中降钙素基因相关肽免疫反应性神经支配．J. Vis. Exp. (2021)．

本视频展示了一种利用荧光显微镜追踪硬脑膜感觉神经元起源的方法。将逆行示踪剂注入麻醉大鼠暴露的硬脑膜中。感觉神经元的轴突摄取该示踪剂，并逆行运输至其位于三叉神经节和颈段背根神经节内的胞体。随后对神经节进行切片，使用标记示踪剂和胞体内神经肽的抗体进行染色，并通过荧光显微镜分析，以确认感觉神经元的神经节来源。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 使用氟金（fluorogold, FG）进行逆行示踪研究

1. 手术操作
   1. 确定大鼠颅骨硬脑膜上的目标坐标区域。
   2. 准备一支10 µL微量注射器，并用液体石蜡进行测试。
   3. 通过腹腔注射三溴乙醇溶液（150 mg/kg）对大鼠进行麻醉。通过夹趾无反应来检查麻醉深度。
   4. 使用电动剃刀剃除大鼠头部的毛发。
   5. 将钝性耳杆安装在大鼠耳朵上，并将其固定于立体定位仪上。然后安装口部固定器，并在眼睛上涂抹眼用软膏。
   6. 使用10%聚维酮碘对头部手术区域皮肤进行清洁，随后使用75%乙醇消毒。
   7. 沿头皮正中线做一纵向切口。
   8. 使用无菌棉签钝性剥离颅骨表面的骨膜和肌肉组织（图1A）。
   9. 使用球形钻头（#106）在左侧顶骨和颞骨、脑膜中动脉（MMA）上方钻一个小孔（约5–7 mm），并确保颅骨硬脑膜保持完整（图1B）。
   10. 使用牙科硅酸盐水泥在孔周围建立一个围堤，以限制示踪剂扩散（图1C）。
   11. 使用10 µL微量注射器将2 µL 2% FG加入MMA周围的孔中（图1D）。
   12. 用一小块止血海绵覆盖孔洞。
   13. 在孔上放置一块石蜡膜，并用骨蜡密封边缘，以防止示踪剂泄漏并避免污染周围组织。
   14. 使用无菌缝线缝合伤口。
   15. 将大鼠置于温暖环境中，直至其完全苏醒。
   16. 将大鼠送回笼中，并在饮水中添加抗生素和镇痛剂。
2. 灌流与切片
   1. 存活7天后，对这些大鼠进行灌流。
   2. 解剖取出三叉神经节（TG）和C1–4背根神经节（DRGs），随后进行后固定和抗冻保护处理（图1F）。
   3. 使用恒冷切片机系统将TG和DRGs以矢状方向切成30 µm厚度的切片，并贴附于硅烷涂层的载玻片上。
3. TG和DRGs中FG与降钙素基因相关肽（CGRP）的双重免疫荧光标记
   注意：尽管无需额外染色即可在汞灯紫外（UV）照明下直接观察FG标记，但为进一步研究硬脑膜CGRP免疫反应性神经纤维在TG和颈段DRGs中的起源，仍使用FG与CGRP的双重免疫荧光法对TG和颈段DRGs中标记的神经元进行进一步检测。
   1. 使用组织化学笔圈出切片区域。
   2. 将切片在封闭液（含3%正常驴血清和0.5% Triton X-100的0.1 M磷酸盐缓冲液（PB））中孵育30分钟。
   3. 将样本转移至含兔抗荧光金抗体（1:1000）和小鼠抗CGRP抗体（1:1000）的溶液中（溶剂为含1%正常驴血清和0.5% Triton X-100的0.1 M PB），4 °C下孵育过夜。
   4. 次日，用0.1 M PB将切片清洗三次。
   5. 在含驴抗兔Alexa Fluor 594（1:500）和驴抗鼠Alexa Fluor 488（1:500）的混合二抗溶液（溶剂为含1%正常驴血清和0.5% Triton X-100的0.1 M PB）中室温孵育1.5小时。
   6. 清洗切片并加盖盖玻片。
4. 观察与记录
   1. 使用配备数码相机的荧光显微镜在紫外（UV）照明下拍摄TG和DRGs中FG标记的神经元图像。
   2. 使用配备数码相机的荧光显微镜拍摄TG和DRGs中FG与CGRP双重标记的神经元图像。
   3. 使用图像编辑软件调整图像的亮度和对比度，并在图片中添加标注。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG (H+L)	赛默飞世尔科技旗下 Invitrogen	A21202	避光保存；RRID: AB_141607
脑立体定位仪	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	荧光显微镜软件
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	避光保存
荧光成像系统	Olympus	BX53
冷冻切片机	Thermo	Microm International GmbH
微型钻机	Saeyang Microtech	Marathon-N7
小鼠抗 CGRP 抗体	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
正常驴血清	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	避光保存
Photoshop 和 Illustrator	Adobe	CS6	图像编辑软件
兔抗 Fluorogold 抗体	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley 大鼠	中国食品药品检定研究院	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus 显微镜载玻片	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm