使用共聚焦显微镜监测斑马鱼激光消融后中间神经丘细胞的恢复

摘要

来源： Volpe, B. A., et al. 基于共聚焦显微镜的斑马鱼中间神经丘细胞激光消融与再生检测实验. J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了利用共聚焦显微镜通过延时荧光成像技术监测斑马鱼神经丘间细胞的恢复过程，实时追踪细胞死亡与修复动态。

方案

1. 消融后成像与延时显微镜技术用于研究再生过程

1. 单击“Channels”下拉菜单。在通道设置中，取消勾选“DAPI”（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）通道以关闭消融激光。然后单击“Acquisition mode”下拉菜单。
2. 在采集模式中，单击“Zoom”。
3. 通过滑块或直接输入“0.7”将放大倍数降低至0.7。
   1. 为确保细胞消融成功，将增益调高至900，并快速扫描视野。
      注意：目标细胞或细胞群内不应有可见的GFP（绿色荧光蛋白）。使用与消融前成像相同或类似的设置，采集并保存消融后的图像（图1C）。如果图像显示仍有荧光细胞残留或存在需要清除的额外细胞体，请重复激光消融步骤，以在成串的中间神经丘细胞中形成可见的空隙。
   2. 检查T-PMT（透射式光电倍增管）通道图像以进一步确认细胞损伤情况。受损细胞将呈现颗粒状外观，细胞核常出现肿胀或形态不规则（图2）。
4. 在完成每个独立阶段位置的消融前图像采集、必要时进行细胞消融以及消融后图像采集后，通过激活阶段位置和时间选项来设置延时显微成像。将时间参数设置为24小时或其它所需终点，时间间隔设为15分钟。启动实验以采集图像，并在实验完成后（次日）保存结果文件。
5. 若需对幼鱼进行进一步研究或饲养，请使用精细镊子小心将其从琼脂糖中取出，然后转移至不含三卡因的E3培养基中恢复。若不再使用，则应根据批准的动物实验方案实施安乐死（常用方法为快速并持续浸入冰浴），并按机构要求进行处理。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12孔聚四氟乙烯印刷载玻片	电子显微镜科学公司	63425-05
15 mM Tricaine 储存液	Sigma	E10521	反渗透水中含15 mM Tricaine
1X E3 + 600 µM Tricaine			将15 mM Tricaine储存液在1X E3培养基中稀释25倍
1X E3 培养基			将60X E3培养基用反渗透水稀释至1X（16.7 ml/L）
60X E3 培养基	所有组分购自Sigma-Aldrich		34.4 g NaCl、1.52 g KCl、5.8 g CaCl₂·2H₂O、9.8 g MgSO₄·7H₂O 溶于1升反渗透水中
配备汞弧灯荧光装置的Bx60复合显微镜	Olympus
配备405 nm、488 nm和555 nm或561 nm激光器的LSM 700共聚焦显微镜	Carl Zeiss Microscopy, LLC		使用5 mW 405 nm激光进行消融；消融和成像通过数值孔径（NA）为1.40的63倍Plan-Apochromat物镜完成
FIJI/ImageJ 图像处理软件	多位贡献者		可在 https://fiji.sc/ 下载
改装为毛刀的解剖针	Fisher Scientific	19010	将一根睫毛粘在木质手柄解剖针的末端
Microsoft Excel 软件	Microsoft Corp.		Google Sheets 是 Microsoft Excel 的免费替代方案
底部为玻璃的35 mm培养皿，带1.5号盖玻片，20 mm窗口	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm培养皿，20 mm玻璃窗口
Immersol 518F 浸油	Fisher Scientific	12-624-66A
低凝胶温度琼脂糖	Sigma Life Science	A9414-256
Corning Netwell 插件，带74 µm聚酯网，24 mm插入件	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio 软件	Rstudio PBC		可在 https://rstudio.com/ 下载
SMX-168-BL 体视显微镜	Motic
移液管	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN 软件	Carl Zeiss Microscopy, LLC