小鼠结肠肌间神经丛肠道神经元和神经胶质细胞活动的钙成像

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1.准备改良的 Krebs 缓冲液。

制备改良的克雷布斯缓冲液，使组分的最终浓度（以mM为单位）如下：121 NaCl、5.9 KCl、2.5 CaCl₂、1.2 MgCl₂、1.2 NaH₂PO₄， 10 个 HEPES， 21.2 NaHCO₃， 1 个丙酮酸和 8 个葡萄糖（用 NaOH 调节 pH 值至 7.4）。加入 3 μM 尼卡地平和 1 μM 东莨菪碱，以抑制 Ca²⁺ 成像和整装解剖过程中的肌肉收缩。

2. 成像和分析

注： 至少使用基本的成像装置，包括荧光光源、显微镜、高质量的CCD相机和适当的采集软件。根据光源和特定应用改变其他组件的添加。滤光片转轮和快门必须与传统的氙弧光源一起使用。但是，LED 光源和照明系统不需要这些组件。

1. 将记录室置于显微镜下，并使用带有多个加热注射器储液器的重力流灌注系统建立 2-3 ml/min 的 37 °C 克雷布斯缓冲液的连续灌注速率。确保防止在连接到真空阱的进料管路和抽吸管路中形成气泡。
2. 在明场照明下聚焦所需的神经丛。避免过度暴露组织，这可能会导致光漂白。
3. 检查神经节内的 Fluo-4 负载并选择健康的神经节进行成像。不健康/受损的神经节将表现出自发荧光或点状形态，不应用于成像。
4. 选择神经节后，将光路转移到相机并使用图像采集软件获取实时图像。确保神经节清晰对焦，并设置图像采集速率和曝光时间。
   注意：图像采集速率和时间将根据调查人员希望记录的事件而变化。对于大多数实验，神经胶质细胞传统上以 0.5-1 Hz 的频率获取图像，神经元以高达 2-10 Hz 的频率获取图像，因为神经胶质细胞 Ca²⁺{{}} 响应不如神经元中的 Ca²⁺ 瞬变快。
5. 开始实验并建立30秒的基线活性
6. 使用重力流灌注系统以2-3毫升/分钟的速度涂抹预先加热的感兴趣药物，如受体激动剂和拮抗剂。在激动剂/拮抗剂的应用后，恢复正常缓冲液的灌注，并允许至少10分钟的洗涤/恢复期。
   注：药物应用时间将根据单个化合物和实验设计而有所不同。一般来说，20-30 秒的激动剂应用足以激活神经元和神经胶质细胞中的 G 蛋白偶联受体。然而，配体门控离子通道（如烟碱乙酰胆碱受体）需要的应用时间不超过 5-10 秒。进一步的持续时间暴露将导致配体门控离子通道迅速脱敏。拮抗剂应应用约 3-15 分钟，以确保完全阻断受体通路。然而，这是一个粗略的概括，研究人员应始终在其特定范式中优化任何实验药物。
7. 停止录制并查看实验的延时电影。使用适当的图像分析软件仔细选择感兴趣的区域 （ROI）。
8. 使用软件对 ROI 荧光强度进行归一化，并将其与初始基线荧光值进行比较。归一化荧光的变化与 [Ca²⁺] 的变化成正比。
   1. 使用前面描述的方法的修改，使用 ΔF/F = （（F1− F0）/F0）ROI − （（F1− F0）/F0）背景，其中 F1 是任何给定点的荧光，F0 是基线荧光，以提高评估准确性。这种修饰有助于减少组织制剂中荧光变化的噪音，这些组织制剂表现出肌间神经丛下方肌肉层的运动。