小鼠结肠肌间神经丛中肠神经元与胶质细胞活动的钙成像

摘要

来源： Fried, D. E., Gulbransen, B. D. 肠神经系统原位 Ca²⁺ 成像. J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了利用钙成像技术对小鼠结肠肌间神经丛标本中的肠神经元和胶质细胞活动进行可视化与分析的方法。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1.配制改良 Krebs 缓冲液。

配制改良 Krebs 缓冲液，使其各组分的终浓度（单位为 mM）如下：121 NaCl、5.9 KCl、2.5 CaCl₂、1.2 MgCl₂、1.2 NaH₂PO₄、10 HEPES、21.2 NaHCO₃、1 吡咯酸（pyruvic acid）和 8 葡萄糖（glucose）（用 NaOH 将 pH 调至 7.4）。加入 3 μM 尼卡地平（nicardipine）和 1 μM 东莨菪碱（scopolamine）以抑制在 Ca²⁺成像和整体组织解剖过程中发生的肌肉收缩。

2. 成像与分析

注意： 使用至少配备荧光光源、显微镜、高质量CCD相机及相应采集软件的基本成像系统。根据光源类型和具体应用，可灵活调整其他组件的配置。使用传统的氙弧灯光源时，必须配备滤光轮和快门；而LED光源及照明系统则无需这些组件。

1. 将记录室置于显微镜下，使用配备多个加热注射器储液器的重力灌流系统，以2–3 ml/min的流速持续灌注37 °C的Krebs缓冲液。确保输入管路和连接至真空捕集装置的吸液管路中均无气泡产生。
2. 在明场照明下将目标神经丛调至清晰对焦。避免组织过度曝光，以防发生光漂白。
3. 检查神经节内Fluo-4的加载情况，选择健康的神经节进行成像。不健康或受损的神经节会表现出自发荧光或点状形态，不应用于成像。
4. 选定神经节后，将光路切换至相机，并使用图像采集软件获取实时图像。确保神经节处于对焦状态，并设定图像采集速率和曝光时间。
   注意：图像采集速率和时间将根据研究人员希望记录的事件而有所不同。在大多数实验中，胶质细胞的传统采集速率为0.5–1 Hz，而神经元则可达2–10 Hz，因为胶质细胞的Ca²⁺反应不像神经元中的Ca²⁺ 瞬变那样迅速。
5. 开始实验，并建立30秒的基础活动基线。
6. 使用重力灌流系统以2–3 ml/min的流速施加预热的感兴趣药物（如受体激动剂和拮抗剂）。在施加激动剂/拮抗剂后，恢复至正常缓冲液灌流，并给予至少10分钟的冲洗/恢复期。
   注意：药物施加时间将根据具体化合物和实验设计而异。通常，20–30秒的激动剂施加足以激活神经元和胶质细胞中的G蛋白偶联受体。然而，配体门控离子通道（如烟碱型乙酰胆碱受体）的施加时间不应超过5–10秒，更长时间会导致此类通道快速脱敏。拮抗剂应施加约3–15分钟，以确保受体通路的完全阻断。但这是粗略的概括，研究人员应在特定实验范式中优化所用药物的条件。
7. 停止记录，查看实验的时间序列视频。使用适当的图像分析软件仔细选择感兴趣区域（ROI）。
8. 使用软件将ROI的荧光强度归一化，并与其初始基础荧光值进行比较。归一化荧光的变化与[Ca²⁺]的变化成正比。
   1. 采用先前描述方法的一种改进形式：ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)背景，其中F1为任意时间点的荧光值，F0为基础荧光值，以提高评估准确性。该改进有助于降低因肠肌神经丛下方肌层运动导致的组织制备中荧光变化的噪声。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fluo-4 AM 染料	Invitrogen	F-14201
葡萄糖	Sigma	G8270
昆虫针	Fine Science Tools	Minutien Pins
iQ 活细胞成像软件	Andor	Andor iQ3
氯化钾	Sigma	P3911
氯化镁	Sigma	M9272
氯化钠	Sigma	S9888
磷酸二氢钠	Sigma	S8282
碳酸氢钠	Sigma	S6014
Neo sCMOS 相机	Andor	Neo 5.5 sCMOS
硝苯地平	Sigma	N7510
蠕动泵	哈佛仪器	型号 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
丙磺舒	Molecular Probes	P36400
东莨菪碱	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning	184
温度控制器	Warner Instruments	TC-344C