使用荧光染料电泳法在固定的小鼠脑切片中可视化星形胶质细胞形态

摘要

来源： Moye, S. L., et.al. 利用荧光黄电泳技术可视化星形胶质细胞形态。 J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了如何利用荧光染料电泳技术研究固定脑切片中星形胶质细胞的形态。具体步骤包括使用电极穿刺星形胶质细胞胞体，在低电压电流作用下将阴离子型亲水性染料导入胞浆，使染料扩散并标记胞体及其突起。随后通过共聚焦显微镜观察标记的星形胶质细胞，从而获得其形态学信息。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 通过离子电渗法填充星形胶质细胞

1. 测试电极。
   1. 将脑片轻轻放入盛有0.1 M PBS的玻璃底培养皿中，室温下保存。用带尼龙线的铂金丝网固定脑片位置。
   2. 确保电极已连接至电压源，并将接地电极置入含有脑片的浴槽中。
   3. 移动物镜至目标脑区。
   4. 将电极缓慢降至溶液中。在明场下将其移至视野中央，并使用40倍水浸物镜仔细检查，确保电极清晰无杂质或气泡。若电极尖端有堵塞，应更换新电极。
      注意：200 MΩ电极易发生堵塞。每次实验前通过离心和过滤染料溶液可避免频繁出现此问题。然而，由于电极尖端较小，组织有时可能卡在开口处。作者尚未找到预防方法，但可通过更换新电极轻松解决。
   5. 在明场下，缓慢将电极向脑片方向降低，停在脑片表面稍上方。
2. 通过离子电渗法填充星形胶质细胞。
   1. 使用红外差分干涉相衬显微镜（IR-DIC）识别位于切片表面下40−50 µm处的星形胶质细胞。寻找细胞体呈细长椭圆形、直径约10 µm的细胞。选定星形胶质细胞后，将其移至视野中央。
      注意：适合进行离子电渗的细胞应具有清晰明确的边界。避免选择过于靠近切片表面的细胞，因其无法完全填充。通常需要数天练习才能熟练识别用于染料填充的星形胶质细胞。根据实验所用脑区的不同，星形胶质细胞的数量可能有所差异，这可能影响填充前识别细胞所需的时间。
   2. 缓慢将电极尖端插入切片，穿过组织，直至与细胞体处于同一平面。
      注意：移动电极时应缓慢，以避免损伤组织。
   3. 当星形胶质细胞的细胞体清晰可见并轮廓分明时，缓慢而轻柔地向前推进电极，直至电极尖端刺入细胞体。缓慢上下调节物镜焦距，确认电极是否已进入细胞体内部。
      注意：电极尖端必须进入细胞体内，并应观察到细胞体上出现微小凹陷。切勿进一步移动电极，以防尖端穿透细胞。
   4. 一旦电极尖端进入细胞，开启刺激器，电压设为约0.5−1 V，并持续向细胞内注入电流。使用共聚焦显微镜观察细胞填充过程。增加数字放大倍数以观察细胞细节，并确保电极尖端在细胞内可见。
      注意：若发现染料从细胞中泄漏或扩散至周围其他细胞，应降低电压。若染料仍持续泄漏，应缓慢撤出电极并另选细胞。为获得最终图像中较高的信噪比，必须防止染料泄漏。
   5. 等待约15分钟，直至细小分支和突起清晰可见，关闭电压，然后轻柔地将电极尖端从细胞中撤出。
3. 对已填充的细胞进行成像。
   注意：填充后可立即进行成像。使用数值孔径（NA）更高的物镜可获得更佳分辨率。
   1. 等待细胞恢复原始形态后再进行成像（15−20分钟），使用40倍物镜。为成像，调整共聚焦显微镜设置，确保细小分支和突起清晰可见。
   2. 设置z轴堆栈，步长为0.3 µm。成像时，移动物镜直至无细胞信号，设为顶部；然后向下移动物镜（穿过细胞聚焦），直至无信号，设为底部。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带细丝的硼硅酸盐玻璃移液管	World Precision Instruments	1B150F-4
共聚焦激光扫描显微镜	Olympus	FV1000MPE	可使用类似替代品
Imaris 软件（版本 7.6.5）	Bitplane Inc.		可使用类似替代品
荧光黄 CH 二锂盐	Sigma	L0259
荧光黄 CH 二钾盐	Sigma	L0144
物镜（40x）	Olympus	LUMPLFLN 40XW	可使用类似替代品
物镜（60x）	Olympus	PlanAPO 60X	可使用类似替代品
PBS 片剂，100 mL	VWR	VWRVE404	可使用完全相同的替代品
移液管微操作器 - ROE-200 型	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200	可使用类似替代品
氯化钾	Sigma	P3911	可使用完全相同的替代品
刺激器 - Omnical 2010 型	World Precision Instruments	Omnical 2010	可使用类似替代品