包埋 果蝇 用于昼夜节律钟神经元延时成像的脑组织三维基质培养法

摘要

来源： Sabado, V., 等人， Nagoshi, E. 单细胞分辨率荧光活体成像 黑腹果蝇 幼虫脑培养中的昼夜节律钟 J. Vis. Exp. (2018).

本视频展示了将Drosophila脑组织包埋于纤维蛋白基质中，随后进行荧光延时成像以分析昼夜节律起搏神经元的节律性活动，该活动与明/暗周期同步。

方案

1. 脑组织外植体在三维基质中的包埋与固定（约20分钟）。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	我不确定它们是否与我们实验室中使用的完全相同。在有选项的情况下，我选择了“适用于昆虫细胞培养”的产品。
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
MgSO₄4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO₃3	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+)葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
酵母提取物	Sigma-Aldrich	Y1000
胰岛素	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B4429
L-(−)-苹果酸	Sigma-Aldrich	M7397
D-(+)-海藻糖二水合物	Sigma-Aldrich	T0167
琥珀酸	Sigma-Aldrich	S9512
富马酸	Sigma-Aldrich	F8509
αα-酮戊二酸	Sigma-Aldrich	K1128
非热灭活、经支原体和病毒检测的胎牛血清（FCS）	BioConcept Ltd. Amimed	2-01F30-I
HEPES-KOH，pH 7.4	嵌入脑组织外植体于三维基质并固定（约20分钟）。将解剖所得脑组织浸入纤维蛋白原工作液（纤维蛋白原终浓度约3.3 mg/mL，每脑组织10.5 µL），操作如下：吸取3.5 µL Schneider活性培养基（SAM）/抗生素溶液。使用同一枪头将解剖孔中的脑组织吸入，不排出枪头内的SAM/抗生素培养基。将脑组织及培养基滴加至无菌培养皿盖上。向含脑组织的液滴中加入另外3.5 µL SAM/抗生素溶液和3.5 µL温热的纤维蛋白原/SAM（10 mg/mL）溶液。使用20 µL枪头轻柔吹打混匀脑组织周围的溶液。 注意：此步骤使用移液器而非镊子，可避免对脑组织造成机械刺激。 从液滴中吸取2 µL纤维蛋白原工作液，将其以小圆圈形式滴加至玻璃底培养皿的盖玻片上。加入0.8 µL凝血酶，并立即用枪头快速混匀。纤维蛋白原转化为纤维蛋白并开始聚合。 当观察到白色纤维蛋白基质形成后，用镊子夹取处于纤维蛋白原工作液中的脑组织（步骤1.1），将其置于基质上。将脑组织腹侧朝下放置（便于成像时观察生物钟神经元），并尽可能轻柔地压近盖玻片。纤维蛋白凝块由多层纤维蛋白构成。选择其中一层，以轻微且轻柔的动作将其折叠覆盖于脑组织上方，避免基质脱离。 从凝块的不同部位重复此操作2至3次，以稳定脑组织。 注意：使用镊子操作脑组织时，注意避免使其干燥或受到物理应力。 在包埋好的脑组织上方加入20 µL SAM/抗生素溶液，以终止凝血酶的作用。 重复上述步骤以固定其余脑组织。每个玻璃底培养皿最多可包埋五至六个脑组织。 对于长期活体成像，向内层孔（玻璃部分）加入600 µL SAM/抗生素溶液。将预先裁剪的聚四氟乙烯（PTFE）膜置于培养基上方，并将其粘附于底部塑料部分涂布的真空脂上（图1A）。&K 科学产品	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S5011
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903
牛血浆纤维蛋白原	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	警告：吸入、皮肤接触或吞咽有害。请在层流罩内操作
牛血浆凝血酶	Sigma-Aldrich	T9549	警告：有害健康，需佩戴手套
PDF，NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH	Chi Scientific	定制
真空脂	Sigma-Aldrich	18405
35 mm 培养皿，1.5 号盖玻片，20 mm 玻璃直径，未包被	MatTek	P35G-1.5-20-C
康宁法尔肯易握式组织培养皿	Fisher Scientific	08-772A
无菌 500 mL Steritop-GP 33 mm 螺口瓶顶滤器 0.22 μm	Millipore	SCGPS05RE
聚四氟乙烯（PTFE）膜	Dupont	200A 铁氟龙FEP薄膜
Millex-HV 注射器滤器装置 0.45 µm聚偏二氟乙烯（PVDF），33 毫米，γ 射线灭菌	Millipore	SLHV033RS
Millex-GV 注射器滤器单元 0.22 µm聚偏二氟乙烯（PVDF），33 毫米，γ 射线灭菌	Millipore	SLGV033RS
三孔玻璃解剖皿	任何公司
精细镊子，型号5，Dumont	Fine Science Tools	11254-20
倒置式Tandem扫描器TCS SP5共聚焦显微镜，配备共振扫描器和HyD光电倍增检测器	Leica microsystem CMS GmbH
温度控制培养室	生命成像服务	CUBE & BOX 温度控制系统，定制设计
载物台湿度控制器	活体成像服务	定制
水浸式微分配器：分配器，扩展型微型泵 MP6 系列，以及 Autoimmersion Objective Controller 软件	Leica microsystem CMS GmbH
SUM-stack 创建与 3D 漂移校正插件	ImageJ 软件
10次迭代去卷积	AutoQuant 和 Imaris 软件