小鼠胚胎来源腹侧中脑神经元中钙离子内流的可视化

摘要

来源： Bancroft, E. A., et al. 定量分析原代小鼠中脑神经元中的自发性 Ca²⁺ 流动及其下游效应. J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了从小鼠胚胎中分离的腹侧中脑神经元内钙离子流入的实时可视化过程。通过使用病毒载体表达钙离子指示剂，在共聚焦显微镜下对神经元进行成像，以追踪其在自发性及神经递质诱导的钙活动过程中荧光强度的变化。

方案

1. 铺板细胞

注意：根据经验，每个胚胎可收集约 100,000 个活细胞。经时间同步的 2–3 月龄妊娠小鼠通常每窝产仔 8–10 个胚胎；因此，每只经时间同步的妊娠小鼠可获得的细胞总数约为 100 万细胞。

1. 使用血细胞计数板进行细胞计数，然后用细胞培养基将细胞悬液稀释至 2,000 个细胞/µL。轻轻吹打混匀。
2. 从培养箱中取出带有层粘连蛋白溶液的盖玻片，用真空泵吸除包被后的盖玻片上残留的层粘连蛋白溶液。尽快接种细胞，避免盖玻片完全干燥。每张盖玻片上加入 100 µL 细胞悬液（2.0 × 10⁵ 个细胞/盖玻片），并将培养皿放入 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
3. 向每个培养皿中小心加入 3 mL 细胞培养基，然后放回 37 °C 培养箱中。每周进行两次半量换液，持续 2 周。

2. 细胞培养感染第14天 体外) 使用腺相关病毒（AAV）载体转染 DIV

1. 每皿准备1 mL无血清DMEM培养基，加入1 µL hSyn-GCaMP6f AAV（滴度为1.0 × 10¹³）
2. 吸去每皿中的细胞培养基，更换为含hSyn-GCaMP6f的1 mL无血清Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。将培养皿放回37 °C培养箱中孵育1小时。
3. 吸去含AAV的无血清培养基，更换为3 mL细胞培养基。将培养皿放回37 °C培养箱中。我们发现，AAV感染5–7天可实现理想的GCaMP表达水平。在此病毒感染期间，每隔2–3天更换一次培养基。

3. 体外培养19-21天（DIV）期间的活细胞共聚焦Ca²⁺成像

注意：可在病毒感染后 5-7 天内进行成像。此时间窗口最适合观察到足以检测自发性 Ca²⁺ 活性的荧光蛋白表达水平。

1. 记录缓冲液的制备
   1. 配制 1 L HEPES 记录缓冲液：向 800 mL 无菌蒸馏水 H₂O 中加入 9.009 g NaCl、0.3728 g KCl、0.901 g D-葡萄糖、2.381 g 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、2 mL 1 M CaCl₂ 储存液和 500 µL 1 M MgCl₂ 储存液，用 NaOH 调节 pH 至 7.4，最后定容至 1 L。
   2. 配制 200 mL 20 µM 谷氨酸记录缓冲液：将 40 µL 100 mM 谷氨酸储存液加入上述 HEPES 记录缓冲液中，定容至 200 mL。
2. 共聚焦成像
   1. 向无菌 35 mm 培养皿中加入 3 mL 记录缓冲液。
   2. 从 37 °C 培养箱中取出含有感染细胞的 35 mm 培养皿，用精细镊子小心夹住盖玻片边缘，迅速将其转移至盛有记录缓冲液的培养皿中。将剩余的盖玻片连同培养基放回 37 °C 培养箱。将装有记录缓冲液的培养皿运送至共聚焦显微镜。
   3. 启动成像软件，并在软件初始化过程中进行下一步操作。
   4. 启动蠕动泵，将管路插入记录缓冲液中，调节流速至 2 mL/min。
   5. 将感染的盖玻片从 35 mm 培养皿转移至记录浴槽中。
   6. 使用 10× 水浸物镜和明场（BF）照明找到焦平面，并寻找神经元胞体密度较高的区域。切换至 40× 水浸物镜，使用 BF 光重新对焦样本。
   7. 在 FluoView 的“Dyes list”窗口中选择 AlexaFluor 488 并应用。
   8. AAV 表达水平可能存在差异，因此为避免荧光染料过度曝光和光漂白，应从较低的高压（HV）和激光功率设置开始。对于 AlexaFluor 488 通道，将高压（HV）设为 500，增益设为 1×，偏移量设为 0；将 488 激光线的功率设为 5%。为增加 z 平面成像的有效体积，将针孔尺寸增大至 300 µm。使用“focus x2”扫描模式，将发射信号优化调节至接近但未达到饱和的水平。此后可根据需要调整参数，直至各通道达到理想的可见度。
      注意：为准确捕捉 GCaMP 所反映的 Ca²⁺ 流动的完整范围，应调节基础 HV 和激光功率设置，使荧光强度增加时不会使探测器过饱和。
   9. 显微镜参数优化后，移动载物台，定位至多个细胞显示 GCaMP6f 荧光自发变化的区域，并对焦至所需的成像平面。
   10. 使用“Clip rect”工具将成像帧裁剪至可实现略低于 1 秒帧间隔的尺寸，以确保成像间隔设定为每秒 1 帧。
   11. 将“Interval”窗口设为 1.0，“Num”窗口设为 600。
       注意：为在预定时间点（300 s）准确递送不同的记录缓冲液，必须校准泵输送新溶液至浴槽的延迟时间。该延迟取决于灌流速率（2 mL/min）以及用于输送溶液的管路长度。
   12. 选择“Time”选项，然后使用“XYt”扫描模式开始采集时间序列图像。
   13. 观察成像进度条，并在合适的时间点（例如，若泵的延迟校准为 60 s，则在第 240 帧时）将管路从 HEPES 记录缓冲液切换至 20 µM 谷氨酸记录缓冲液，以确保在 300 s 时递送谷氨酸。
   14. 成像完成后，点击 Series Done 按钮，保存完成的时间序列图像。继续用 20 µM 谷氨酸灌流 5 分钟，使培养的神经元总共暴露于谷氨酸 10 分钟。对每张需成像的盖玻片重复此过程。
   15. 在额外暴露于 20 µM 谷氨酸 5 分钟后，将盖玻片从浴槽中取出，并放回含有记录缓冲液的 35 mm 培养皿中，直至完成当天的成像工作。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 未包被塑料细胞培养皿	VWR	25382-348
光纤照明光源，100 V	Kent Scientific	KSC5410
滤器系统，PES 22μm 250mL	VWR	28199-764
Fluoview 1000 共聚焦显微镜	奥林巴斯
Fluoview 1200 共聚焦显微镜	Olympus
Hanks平衡盐溶液 (HBSS) 1x	ThermoFisher	14175095	500 mL
HEPES	VWR	101170-478
HeraCell 150 CO₂ 培养箱	Heraeus（赛默飞世尔科技）
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
L-谷氨酸	VWR	97061-634
氯化镁（MgCl₂），无水	Sigma-Aldrich	M8266
MPII 微型蠕动泵，115/230 VAC，50/60 Hz	哈佛仪器	70-2027
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	Addgene	100837-AAV1	滴度：1.00×10¹³ gc/ml
氯化钾（KCl），无水	Sigma-Aldrich	746436
MPII 泵头管件	哈佛仪器	55-4148
氯化钠（NaCl），无水	Sigma-Aldrich	746398
妊娠时间明确的雌性 C57BL/6 小鼠	德克萨斯A&M 基因组医学研究所