小鼠胚胎来源腹侧中脑神经元中钙离子内流的可视化

摘要

来源： Bancroft, E. A., et al. 定量分析原代小鼠中脑神经元中的自发性 Ca²⁺ 流动及其下游效应. J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了从小鼠胚胎中分离的腹侧中脑神经元内钙离子流入的实时可视化过程。通过使用病毒载体表达钙离子指示剂，在共聚焦显微镜下对神经元进行成像，以追踪其在自发性及神经递质诱导的钙活动过程中荧光强度的变化。

方案

1. 铺板细胞

注意：根据经验，每个胚胎可收集约 100,000 个活细胞。经时间同步的 2–3 月龄妊娠小鼠通常每窝产仔 8–10 个胚胎；因此，每只经时间同步的妊娠小鼠可获得的细胞总数约为 100 万细胞。

1. 使用血细胞计数板进行细胞计数，然后用细胞培养基将细胞悬液稀释至 2,000 个细胞/µL。轻轻吹打混匀。
2. 从培养箱中取出带有层粘连蛋白溶液的盖玻片，用真空泵吸除包被后的盖玻片上残留的层粘连蛋白溶液。尽快接种细胞，避免盖玻片完全干燥。每张盖玻片上加入 100 µL 细胞悬液（2.0 × 10⁵ 个细胞/盖玻片），并将培养皿放入 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
3. 向每个培养皿中小心加入 3 mL 细胞培养基，然后放回 37 °C 培养箱中。每周进行两次半量换液，持续 2 周。
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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 未包被塑料细胞培养皿	VWR	25382-348
光纤照明光源，100 V	Kent Scientific	KSC5410
滤器系统，PES 22μm 250mL	VWR	28199-764
Fluoview 1000 共聚焦显微镜	奥林巴斯
Fluoview 1200 共聚焦显微镜	Olympus
Hanks平衡盐溶液 (HBSS) 1x	ThermoFisher	14175095	500 mL
HEPES	VWR	101170-478
HeraCell 150 CO₂ 培养箱	Heraeus（赛默飞世尔科技）
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
L-谷氨酸	VWR	97061-634
氯化镁（MgCl₂），无水	Sigma-Aldrich	M8266
MPII 微型蠕动泵，115/230 VAC，50/60 Hz	哈佛仪器	70-2027
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	Addgene	100837-AAV1	滴度：1.00×10¹³ gc/ml
氯化钾（KCl），无水	Sigma-Aldrich	746436
MPII 泵头管件	哈佛仪器	55-4148
氯化钠（NaCl），无水	Sigma-Aldrich	746398
妊娠时间明确的雌性 C57BL/6 小鼠	德克萨斯A&M 基因组医学研究所