来源： Calvo-Rodríguez, et al. 老化海马神经元中亚细胞 Ca2+ 的荧光与生物发光成像. J. Vis. Exp. (2015).
本视频展示了利用荧光成像技术测定短期和长期大鼠海马神经元培养物中胞质钙水平的方法。通过比较年轻与衰老的神经元，揭示了衰老神经元中L型电压门控钙通道密度增加以及激活时间延长导致钙超载的现象，这是神经元衰老的典型特征。荧光钙指示剂通过刺激后荧光强度的变化，显示出这些差异。
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方法文章
短期与长期大鼠海马神经元培养物的体外钙成像
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2025年5月29日
本文内容
摘要
方案
1. 大鼠海马神经元的短期与长期培养
- 聚-D-赖氨酸包被的12 mm玻璃盖玻片的制备
- 将直径为12 mm的玻璃盖玻片在乙醇中灭菌至少24小时。在无菌条件下使其干燥。
- 将盖玻片均匀分布在培养皿中的一条石蜡膜上，用200 μL溶液覆盖每张盖玻片的表面 µ1 mg/ml 多聚-D-赖氨酸溶液。置于过夜（O/N）孵育。
- 第二天，在无菌条件下，每15分钟用双蒸馏无菌水清洗一次盖玻片，持续90分钟。
- 用500 μL的培养基填充四孔多孔培养板 µ每孔加入 l Neurobasal 培养基。Neurobasal 培养基应添加 10% 胎牛血清、2% B27、1 µg/ml 庆大霉素和 2 mM L-谷氨酰胺
- 将盖玻片置于多孔培养板中，并在37℃、湿润的5% CO₂培养箱中培养。 ºC 和 5% CO₂2 孵育器中保存至使用。
- 从新生大鼠中分离海马神经元
- 准备1.8 ml木瓜蛋白酶溶液（直接购买），置于离心管中（20 µl/ml）的无菌条件下：以获得 20 的终浓度 µl/ml 加入约 40 µl papain 溶于 1.8 ml Hank's 液并含 0.6% 牛血清白蛋白（BSA， µl 应根据供应商的条件进行计算。0.6% BSA 的 Hank's 溶液通过将 85 ml 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）培养基与 15 ml 的 4% 牛血清白蛋白（BSA，由 4 g BSA 溶于 100 ml HBSS 中制备）混合配制而成。应在无菌操作台中配制。
- 将木瓜蛋白酶在含 0.6% BSA 的 Hank's 溶液中 37℃ 孵育 30 分钟 º使用前置于 C。使用 0.22 μm 滤膜过滤溶液 µm 滤光片，使用前
- 在900 ml双蒸灭菌水中加入杜尔贝科改良伊格尔培养基粉末（13.5 g/L），配制汉姆F-12培养基。然后加入6 g 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和336 mg NaHCO₃3 并使用 4 N NaOH 将 pH 调至 7.42。加入无菌水定容至 1 L，然后使用 0.20 μm 滤膜过滤。 µm 聚醚砜（PES）瓶顶滤器。该操作需在无菌罩中进行。最后用 CO₂ 饱和溶液2 使用前需在无菌条件下操作。溶液储存于4 ºC 并冷藏使用。
- 通过断头法处死新生（P0）大鼠幼崽，并用无菌HBS培养基清洗头部。使用无菌剪刀打开颅骨，用刮勺取出脑组织，并迅速在Ham's F-12培养基中清洗。
- 在每个半球用手术刀进行斜切图1B）并将其转移至含有 Ham's F-12 培养基的培养皿中。
- 在放大镜下，使用解剖镊小心地去除脑膜。
- 使用放大镜在大脑皮层上一个特征性的凹陷位置识别海马体。然后，用眼科剪刀小心地从一侧边缘开始分离海马体，将其从皮层中剥离并取出。
- 将海马组织转移至含有无钙无菌Hank's培养基的4孔板中2+ 和 Mg2+ 加入0.6% BSA并洗涤海马组织。使用相同的手术剪，在不移除培养基的情况下将组织切成小块（约2 × 2 mm）。
- 将海马组织块转移至含有1.8 ml预过滤木瓜蛋白酶溶液的样品瓶中，随后在37 ºC，偶尔轻轻摇动。15分钟后，加入90 µDNase I 溶液 1 升（50） µg/ml 终浓度），再孵育 15 分钟。
- 将组织转移至10 ml离心管中，用新鲜的Neurobasal培养基洗涤组织碎片。通过5 ml塑料移液管反复吹打组织碎片，获得细胞悬液。
- 以 160 × g 离心细胞悬液 5 分钟。使用无菌塑料巴斯德吸管弃去上清液，并用 1 ml 自动移液器将沉淀轻轻重悬于 1 ml Neurobasal 培养基中。
- 使用血细胞计数板测量细胞密度。将玻璃盖玻片盖在血细胞计数板上，加入10 µ细胞悬液。确保细胞悬液均匀进入腔室且无气泡产生。在显微镜下计数细胞数量，并进行相应计算，以获得含有40–80个细胞的适宜液滴 µl 含有 30 x 103 细胞。细胞总数取决于所使用的动物数量。
- 大鼠海马神经元的短期与长期培养
- 在含有500的四孔多孔培养板上 µl 神经基础培养基（Neurobasal Culture Medium），提前配制并置于培养箱中预热，接种约 30 x 103 约50微升液滴中的细胞 µ每孔加入 l，加入至含一片经多聚-D-赖氨酸包被的 12 mm 直径玻璃盖玻片的多孔培养板中。
- 在37℃、湿润环境中培养原代海马神经元细胞 ºC 和 5% CO₂2 培养箱中孵育 2-5 天 体外 （DIV，短期，年轻培养物）或 >15 天（长期，老化培养物）后进行实验，期间不更换培养基。
2. 胞质 Ca2+ 浓度的荧光成像
- 荧光成像用测试溶液的制备。
- 配制含以下成分的外部 HEPES 缓冲盐溶液（HBS，单位：mM）：NaCl 145，KCl 5，MgCl2 1，CaCl2 1，葡萄糖 10，HEPES 钠盐 10（pH 7.42）。
- 配制不含 Mg2+ 的外部 HEPES 缓冲盐溶液（HBS，单位：mM）：NaCl 146，KCl 5，CaCl2 1，葡萄糖 10 和 HEPES 10（pH 7.42）。
- 将 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）溶于不含 Mg2+ 的 HEPES 缓冲盐溶液（HBS）中，终浓度为 100 µM，并加入 10 µM 甘氨酸。
- 配制以 KCl 替代 NaCl 的 HBS 溶液，成分为（单位：mM）：KCl 145，MgCl2 1，CaCl2 1，葡萄糖 10 和 HEPES 10（pH 7.42）。
- 海马神经元细胞负载荧光钙探针 fura2/AM。
- 将含盖玻片的细胞培养物从培养箱中取出，在室温（RT）下用 HBS 培养基洗涤，方法是将其转移至新的四孔多孔板中，每孔加入 500 µl HBS 培养基。
- 在避光条件下，用含 4 µM fura2/AM（溶于相同 HBS 培养基）的溶液于室温（25 ºC）孵育细胞 60 分钟。
- 60 分钟后，用新鲜 HBS 培养基洗涤盖玻片。
- 记录培养细胞中胞质 [Ca2+] 的荧光图像。
- 打开光源、显微镜、灌流系统、荧光相机和计算机。
- 将盖玻片置于倒置显微镜载物台上专用于开放 12 mm 玻璃盖玻片的恒温平台，使用 40X 物镜（油镜，数值孔径 [NA]：1.3）选择观察视野。持续用预热（37 ºC）的 HBS 培养基对细胞进行灌流，灌流过程中可不含或含有测试物质。维持灌流速度约为 5–10 ml/min。
注意：活细胞灌流系统安装在专用于开放 12 mm 玻璃盖玻片的恒温平台上。采用配备阀门控制器的 8 通道重力驱动灌流系统进行溶液灌流。真空泵用于吸除多余培养基。溶液通过管内加热系统进行加热。 - 在两个激发波长下关闭快门，采集背景图像。
- 以 340 nm 和 380 nm 交替进行落射照明。通过荧光相机每 5–10 秒记录一次 520 nm 处发射的荧光信号，该信号经 fura-2 二向色镜过滤。
- 记录结束后，将 520 nm 处发射的完整图像序列保存至计算机，以供后续分析。
- 记录荧光图像的分析。
- 打开实验文件。在 aquacosmos 软件中点击“Ratio”（比值），选择所需的比值范围。计算所得图像中每个像素的比值，以获得一系列比值图像。
- 通过调整“背景消除”进行背景扣除。点击“开始计算”。
- 点击“all times sequence”（全时段序列）按钮，并清除原有的兴趣区域（ROIs）。为进行单个细胞的定量分析，建立对应于单个神经元的新兴趣区域（ROIs）。对每个 ROI 内每个像素的比值进行平均，以获得每个 ROI（细胞）的比值荧光记录。
- 为绘制单个记录曲线，将各 ROI 对应的比值荧光值导出至绘图软件。
- 使用合适的数据分析和绘图软件，计算每次刺激后比值荧光上升幅度的相应数值。
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结果
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Neurobasal 培养基 | |||
| HBSS 培养基 | |||
| Ham's F-12 培养基 | |||
| DNase I（来自牛胰腺） | |||
| 胎牛血清 | |||
| B27 | |||
| 庆大霉素 | |||
| L-谷氨酰胺 | |||
| 12 mm 玻璃盖玻片 | |||
| 木瓜蛋白酶 | |||
| 4 孔多孔培养板 | |||
| 培养皿 | |||
| 无菌移液管 | |||
| Fura2-AM | |||
| Lipofectamine2000 | |||
| NMDA | |||
| 甘氨酸 | |||
| Zeiss Axiovert S100 TV 显微镜 | |||
| Xcite 照明系统 | |||
| ORCA ER 荧光相机 | |||
| VC-8 阀门控制器 | |||
| SH-27B 加热系统 | |||
| Aquacosmos 软件 |
