通过免疫标记与姜黄素染色对脑组织切片中的β-淀粉样蛋白斑块进行成像

摘要

来源： Maiti, P. et. al.,利用天然多酚姜黄素对脑组织中淀粉样斑块进行标记与成像。 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了使用免疫标记和姜黄素染色对脑组织切片中β-淀粉样蛋白斑块进行成像的操作流程。免疫标记可特异性识别β-淀粉样蛋白，而姜黄素可选择性结合富含β-折叠结构的纤维，从而增强可视化效果。红色与绿色荧光的共定位可确认斑块的存在。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物灌注

1. 配制固定液和灌注缓冲液。
   1. 通过加入80 g氯化钠（NaCl）、2 g氯化钾（KCl）、21.7 g磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·7H₂O）、2.59 g磷酸二氢钾（KH₂PO₄）以及双蒸水至总体积1 L，配制0.1 M磷酸钠缓冲液。
   2. 配制4%多聚甲醛（PFA）溶液。
      1. 将40 g多聚甲醛加入1 L磷酸盐缓冲液（PBS）（0.1 M，pH 7.4）中。
      2. 将PFA溶液加热至60−65 °C，并使用磁力搅拌器搅拌。
         注意：温度不得超过65 °C。
      3. 用滴管滴加数滴氢氧化钠（NaOH）（1 N），以完全溶解PFA。
      4. 用中等至细孔滤纸过滤PFA溶液，并于4 °C保存。
         注意：该溶液可保存一个月。
2. 进行动物麻醉和灌注。
   注意：12月龄B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J（ 5倍家族性阿尔茨海默病 (5×FAD)）年龄匹配的对照小鼠（每组n = 6）购自供应商，并在中国台湾彰化师范大学动物房内繁殖。基因分型通过聚合酶链式反应（PCR）确认。人类阿尔茨海默病（AD）脑组织包括死后AD脑组织和年龄匹配的对照组织。
   1. 通过腹腔注射（27 G针头和1 mL注射器）使用适当的麻醉剂（如戊巴比妥钠（390 mg/kg体重）或氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮最高80 mg/kg体重，赛拉嗪10 mg/kg体重））对动物进行麻醉。通过捏压脚趾检查麻醉深度。若动物无反应，则可进行灌注手术。
   2. 将麻醉后的动物仰卧置于灌注手术托盘上，使用小型虹膜剪在左心室后端做切口。
   3. 将22 G灌注针插入左心室，并在右心耳处做一小切口以排出灌注液。使用重力驱动灌注系统，使冰冻的灌注液（0.1 M PBS，pH 7.4）流动5−6分钟（流速20−25 ml/min）。
      注意：肝脏变清亮是灌注充分的指标。
   4. 将缓冲液阀门切换至冰冻的4%多聚甲醛溶液进行固定，使其流动8−10分钟。
      注意：出现震颤后肢体变硬或僵直是固定良好的指标。
   5. 使用剪刀从颅骨中取出脑组织。用刮勺收集脑组织并放入装有4% PFA的样品瓶中（体积至少为脑组织的10倍），于4 °C保存以备后续使用。

2. 组织处理

1. 切片冷冻切片机切片。
   1. 将脑组织转移至梯度蔗糖溶液（10%、20% 和 30%）中，于 4 °C 下分别保存 24 小时，直至使用。
   2. 在 -22 °C 下使用冷冻切片机切取 40 µm 厚的切片。每孔收集 10−20 片切片至含 PBS 和叠氮化钠（0.02%）的 6 孔板中。

3. 将 cur(姜黄素) 与 Aβ 抗体在 Aβ 斑块和寡聚体中进行共定位。

1. 在12孔板中用PBS清洗第2.1.2步的冷冻切片，洗涤3次。
2. 用含0.5% Triton-X-100的PBS溶解10%正常山羊血清（NGS），室温封闭切片1小时。
3. 弃去封闭液，将切片与抗淀粉样蛋白β（Aβ）特异性抗体（6E10或A11，稀释比例1:200）在含10% NGS和0.5% Triton-X-100的新鲜封闭液中于4 °C孵育过夜，摇床转速为150 rpm。
4. 弃去抗体溶液，用PBS洗涤切片3次，每次10分钟。
5. 在避光条件下，室温下用带有红色荧光染料的二抗（例如Alexa
6. 594）孵育1小时。
7. 用PBS洗涤3次，每次10分钟。
8. 用70%乙醇洗涤1次。
9. 用姜黄素（Cur (10 µM)）在室温下孵育切片5分钟。
10. 用70%乙醇洗涤3次，每次1分钟。
11. 依次用90%和100%乙醇各脱水1分钟，再用二甲苯透明2次，每次5分钟，最后用二甲苯可塑剂聚苯乙烯（DPX）封片。
12. 使用配备合适激发/发射滤光片的荧光显微镜观察红色和绿色信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿尔茨海默病动物模型	杰克逊实验室，缅因州巴港
无水乙醇	VWR，宾夕法尼亚州拉德诺
Alexa 594	Santa Cruz Biotech，德克萨斯州达拉斯
6E10 抗体	Biolegend，加利福尼亚州圣地亚哥
A11 抗体	Millipore，马萨诸塞州伯灵顿
冷冻切片机	GMI，明尼苏达州拉姆齐	Leica CM1800
姜黄素	Sigma，密苏里州圣路易斯
磷酸氢二钠	Sigma，密苏里州圣路易斯
二甲苯增塑剂 Dystyrene	BDH，佐治亚州道森维尔
滤纸	Fisher Scientific，宾夕法尼亚州匹兹堡
倒置荧光显微镜	Leica，伊利诺伊州巴达哥尼亚格罗夫	Leica DMI 6000B
倒置荧光显微镜	Olympus，日本新宿	Olympus IX70
正常山羊血清	Sigma，密苏里州圣路易斯
多聚甲醛	Sigma，密苏里州圣路易斯
氯化钾	Sigma，密苏里州圣路易斯
磷酸二氢钾	Sigma，密苏里州圣路易斯
叠氮化钠	Sigma，密苏里州圣路易斯
氯化钠	Sigma，密苏里州圣路易斯
氢氧化钠	EMD Millipore，马萨诸塞州伯灵顿
戊巴比妥钠	Vortex Pharmaceuticals Limited，密歇根州迪尔伯恩
Triton X-100	Sigma，密苏里州圣路易斯
二甲苯	VWR，宾夕法尼亚州拉德诺