利用双光子荧光寿命成像显微技术在小鼠体内可视化蛋白激酶A活性

摘要

来源： Jongbloets, B. C., et al．利用活体双光子荧光寿命成像显微技术在头部固定行为小鼠中可视化蛋白激酶A活性．J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种双光子荧光寿命成像显微技术，用于在强制运动的行为小鼠中观察固定头部状态下蛋白激酶A的活性。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 体内 双光子荧光寿命成像显微技术

1. 在颅窗植入后两周或更长时间，开始进行双光子荧光寿命成像显微术（2pFLIM）成像。为减少实验过程中因应激带来的干扰，在成像研究开始前应频繁抓握和固定小鼠，使其适应操作过程。
2. 使用控制双光子激光器的软件，将双光子激发激光波长设置为 960 nm。
3. 使用 4% 异氟烷对小鼠进行麻醉。通过夹尾测试并观察呼吸频率来确认麻醉效果：夹尾时应无反应，且呼吸频率应降至约每秒 1 次。为尽量减少不必要的操作时间，并因麻醉持续时间仅为两到三分钟，无需使用眼部润滑剂。
4. 将麻醉后的小鼠转移至电动跑步机（图 1C），并将小鼠头板固定于跑步机装置的头板夹具上（详见 图 1）。使用 70% 乙醇清洁小鼠颅窗盖玻片表面。
5. 将固定好小鼠的电动跑步机置于 2pFLIM 物镜下方。在颅窗盖玻片与物镜之间滴加一滴蒸馏水。
6. 让固定后的小鼠从麻醉中苏醒，并至少适应跑步机和显微镜环境 10 分钟。在小鼠苏醒过程中持续监测其呼吸频率。
7. 在落射照明下定位注射位置。在明场下记录参考特征（如血管），以便在后续成像过程中准确定位同一兴趣区域（ROI）。
8. 屏蔽除脑组织发射光以外的所有入射光。关闭落射照明光源，并封闭 2pFLIM 装置的外壳。通过开启硬件命令电压控制，激活 2pFLIM 光电倍增管（PMT）。
9. 使用 2pFLIM 采集软件 FLIMimage 获取 z 轴堆栈 2pFLIM 图像，推荐参数如下，适用于清醒小鼠中 tAKARα 阳性胞体的成像：帧平均设为 3 帧，扫描速度设为 2 ms/线，图像尺寸设为 128 × 128 像素，视场设为 90−100 μm。根据样本制备情况和硬件配置调整成像参数。
10. 在 FLIM 视图（自主开发的定制软件）中检查所获取的图像。根据步骤 1.9 调整成像参数，以优化光子计数并最小化光漂白。

注意：在活体中对 tAKARα 阳性胞体进行荧光寿命成像时，感兴趣区域（ROI）内可接受的整合光子计数约为 1,000−10,000 个光子，具体数值取决于特定刺激所产生的信号幅度。

1. 采用减小的视野、降低的扫描速度、增加的激光功率以及增加的帧数平均次数，以提高总光子计数并减少荧光寿命估计误差。同时，务必使用最低必要的激光功率、帧数平均和扫描速度，以最大限度地减少光漂白。
2. 按照固定的时间间隔（例如，每30−60秒）重复进行z-stack图像采集，采集参数采用步骤1.10中确定的设置。在跑步机速度为零时，至少采集15分钟的基线2pFLIM图像。
3. 在采集2pFLIM图像的同时，将跑步机转速设置为约15 cm/s，持续15分钟。停止跑步机转动后，继续成像至少20分钟，以评估强制运动停止后PKA活性的持续时间。
   

2. 2pFLIM 图像分析

1. 在 FLIMview 中打开获取的图像，并在 FLIMview 中设置以下参数。

1. 在 FLIMview 中点击单光子计数（SPC）的最小值和最大值范围输入框。输入适当的 SPC 最小值和最大值范围，通常分别在 1.2−2 和 10−12 ns 之间。

2. 在 FLIMview 中点击 t₀ 值输入框，并输入 t₀ 值（通常约为 2 ns）。在 FLIMview 中点击荧光寿命强度最小阈值输入框，并将所需的阈值设为 5−30 个光子。

2. 单击新建组按钮（N），并指定一个实验组名称。这将生成一个组合所有添加的 FLIM 图像数据的组。

3. 在 FLIMview 的 ROI 按钮所在的 Roi Controls 模块中点击，并在 tAKARα 阳性的胞体周围绘制一个感兴趣区域（ROI）。通过移动 FLIMview 中 z-stack Control 滑块的下限和上限 z 值，缩小 z 层析范围，以最大限度减少来自其他 z 深度背景光子的信号污染。

4. 单击 + 按钮将 FLIM 图像添加到组中（步骤 2.2）。单击 Calc 按钮，以计算感兴趣区域（ROI）的平均寿命（LT，也称为平均光子发射时间 [MPET]）以及寿命估计误差（δτ）。

5. 打开时间顺序上的下一个2pFLIM成像文件，重复步骤2.4。务必调整感兴趣区域（ROI）的位置和z轴扫描范围，以确保在不同时间点测量的是同一个tAKARα阳性胞体，因为组织可能随时间发生漂移。

6. 在 Group Controls 模块的下拉菜单中选择 deltaMPET/MPET₀。点击 baseline# 字段，并输入索引（例如，对于步骤 2.3 中创建的组中的前五幅图像，输入 1 2 3 4 5）。这将定义用于计算基线寿命（LT₀）的图像。

7. 点击 Plot 以生成包含实验过程中 tAKARα 在所定义 ROI 区域内的荧光寿命成像响应（ΔLT/LT₀）的图表。通过将各个 ROI 区域的荧光寿命变化值（ΔLT）归一化为其相应的基线荧光寿命（LT₀），可实现不同 ROI 区域间运动过程中 PKA 活性的比较。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双光子显微镜	N/A	N/A
ScanImage 3.6	斯沃博达实验室 / 维德里奥科技	N/A
FLIMview MATLAB 软件	N/A	N/A
16倍 0.8 数值孔径 水浸物镜 目的	尼康	MRP07220
AnimalTracker MATLAB 软件	N/A	N/A
立体定位对准系统	David kopf	1900
病毒：tAKARα（AAV2/1 hSyntAKARα-WPRE）	Addgene	119921
头板	N/A	N/A
头板固定器	N/A	N/A
圆形盖玻片（5 mm 直径）	r) VWR	101413-528