使用双光子荧光寿命成像显微镜观察小鼠体内的蛋白激酶 A 活性

Abstract

资料来源：Jongbloets， B. C.， et al。使用体内双光子荧光寿命成像显微镜可视化头部固定行为小鼠的蛋白激酶 A 活性。J. Vis. Exp. （2019）

本视频演示了一种双光子荧光寿命成像显微镜程序，用于可视化头部固定、行为正常的小鼠在强制运动过程中的蛋白激酶 A 活性。

Protocol

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1. In Vivo双光子荧光寿命成像显微镜

1. 在颅窗安装后 2 周或更长时间开始双光子荧光寿命成像显微镜 （2pFLIM） 成像。在成像研究开始之前，通过频繁处理和擦洗鼠标来最大限度地减少由于压力引起的实验干扰，以使小鼠适应。
2. 图 1C图 1 注意： 用于体内 tAKARα 阳性胞体寿命成像的 ROI 中可行的积分光子数为 ~1,000-10,000 个光子，具体取决于特定刺激产生的信号振幅。
   1. 使用减小的视野、降低的扫描速度、增加激光功率和增加要平均的帧数来增加积分光子计数并减少寿命估计误差。同时，请务必使用最低的基本激光功率、帧平均和扫描速度，以最大限度地减少光漂白。
   2. 2.2pFLIM 图像分析

      1.在 FLIMview 中打开采集的图片，并在 FLIMview 中设置以下参数。

      2. 点击 t₀ FLIMview 中的值字段，然后输入 t₀2. 单击新建组按钮 （N）并分配一个实验组名称。这将生成一个组，该组合并了来自每个添加的 FLIM 图像的数据。

      3. 点击 ROI按钮 Roi 控件z-stack Control4. 单击"+"按钮，将 FLIM 图像添加到组中（步骤 2.2）。单击 calc6. 选择 deltaMPET/MPET₀组控件模块。单击baseline#1 2 3 4 5₀）。

      7.单击Plot以生成包含 FLIM 响应 （ΔLT/LT₀₀

Results

Materials