小鼠脑组织中狂犬病病毒感染的三维可视化

摘要

资料来源：Zaeck， L.， et al. 溶剂清除脑组织中狂犬病病毒感染的高分辨率 3D 成像。J. Vis. Exp. （2019）.

本视频演示了制备和成像感染狂犬病病毒（RABV）的小鼠脑组织以评估感染进展的过程。它概述了关键步骤，包括使用荧光标记物进行组织染色、脱水、透明化和共聚焦激光扫描显微镜的安装，最终生成三维表示。

方案

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

使用了受RABV感染、多聚甲醛（PFA）固定的存档脑材料。

注意： 本方案使用各种有毒和/或有害物质， 包括PFA、甲醇（MeOH）、过氧化氢（H₂O₂）、叠氮化钠（NaN₃）、tert-丁醇（待定）、 苯甲醇 （BA）、苯甲酸苄酯 （BB） 和二苯醚 （DPE）。MeOH 和 TBA 是高度易燃的。穿戴适当的个人防护设备（实验服、手套和护目镜）并在通风橱中进行实验，避免接触。将废物单独收集在适当的容器中，并根据当地法规进行处理。狂犬病病毒被归类为生物安全级别 （BSL）-2 病原体，因此通常可以在 BSL-2 条件下处理。某些活动，包括可能产生气溶胶的程序、使用高病毒浓度或处理新型溶血病毒的程序，可能需要 BSL-3 分类。建议对高危人员（包括动物看护人和实验室工作人员）进行暴露前预防。请参阅地方当局法规。

1. 固定脑组织和切片

1. 在4°C下（组织与固定物的比例约为1：10 [v / v]）中，将脑样品固定在适当体积的4%PFA磷酸盐水（PBS [pH 7.4]）中至少48小时。
2. 在 PBS 中洗涤组织样品 3 次，每次洗涤至少 30 分钟，并将它们储存在 0.02% NaN₃/PBS 中，在 4 °C 下直至使用。
3. 使用振动切片机将组织切成 1 mm 厚的切片（刀片进给速率：0.3-0.5 mm/s，振幅：1 mm，切片厚度：1,000 μm）。
4. 为了保持正确的切片序列，请将每个组织切片分别储存在多孔细胞培养板的孔中。加入0.02%NaN₃/PBS，并将组织切片储存在4°C直至使用。

2. 用甲醇进行样品预处理

注： 以温和的振荡方式进行所有孵育步骤，如果没有特别说明，则在室温下进行。保护样品避光。样品预处理的总体目的是通过分别暴露于甲醇和H₂O₂来改善抗体扩散和减少组织自发荧光。

1. 在蒸馏水中制备 20% （v/v）、40%、60% 和 80% MeOH 溶液。例如，对于 20% 的 MeOH，将 10 mL 的 100% MeOH 加入到适当的可密封容器中的 40 mL 蒸馏水中，然后倒置混合。
2. 将样品转移到大小合理的容器中（例如 5 mL 反应管）。注意使用对本协议中使用的试剂具有化学耐受性的材料。例如，请注意，虽然聚丙烯是合适的，但聚苯乙烯则不合适。
   注：本实验步骤中的体积规格是指 5 mL 反应管。如果使用其他容器，请相应地调整体积。
3. 将样品在 4 mL 制备的 MeOH 溶液系列的每种浓度中按升序孵育 1 小时。
4. 将样品在纯 （100%） MeOH 中孵育 2 次，每次 1 小时。
5. 将样品冷却至 4°C（例如，在实验室安全的冰箱中）。
6. 制备漂白溶液（5% H₂O{{}}₂在甲醇中），例如，以1：6的比例稀释30%H{{}}₂O₂原液纯（100%）甲醇，并冷却至4 °C。
7. 从冷藏样品中取出100%甲醇，加入4 mL预冷的漂白液（5%H₂O₂ 在甲醇中）。在4°C下孵育过夜。
8. 将漂白液交换为4 mL 80%甲醇并孵育1小时。继续按降序使用制备的 MeOH 溶液系列，每次 1 小时，直到样品在 4 mL 20% MeOH 中孵育 1 小时。
9. 用 4 mL PBS 洗涤样品 1 次，持续 1 小时。

3. 免疫染色

{{}}{{TAG_234 TAG_235}}注： 进行所有孵育步骤，轻轻振荡，如无特殊说明，则在室温下进行。保护样品避光。为防止微生物生长，将 NaN₃ 添加到本节中的溶液中，使最终浓度为 0.02%。组织样品通过用非离子去污剂 Triton X-100 和 Tween 20 处理进一步透化。正常血清用于阻断非特异性抗体结合。添加甘氨酸和肝素以降低免疫标记背景。

1. 在 4 mL 的 0.2% Triton X-100/PBS 中洗涤样品 2 次，每次 1 小时。
2. 在 37 °C 下用 4 mL 0.2% Triton X-100/20% 二甲基亚砜 （DMSO）/0.3 M 甘氨酸/PBS 透化样品 2 天。
3. 通过将样品在 37 °C 下在 4 mL 0.2% Triton X-100/10% DMSO/6% 正常血清/PBS 中孵育 2 天来阻断抗体的非特异性结合。
   注意： 使用来自产生二抗的同一物种的正常血清，以达到理想的封闭效果。
4. 将样品在 2 mL 一抗溶液（3% 正常血清/5% DMSO/PTwH [含肝素的 PBS-Tween 20] + 一抗/抗体）中于 37 °C 孵育 5 天。2.5 天后刷新一抗溶液。
   1. 对于 PTwH，在蒸馏水中重构肝素钠盐，制成 10 mg/mL 储备液（将此溶液等分储存在 4 °C 下）。将储备溶液加入 0.2% Tween 20/PBS 中，至终浓度为 10 μg/mL。
      注： 选择正确的抗体稀释度可能需要优化。通常，标准免疫组织化学浓度是一个很好的起点。
5. 在 4 mL PTwH 中洗涤样品 1 天，白天至少更换洗涤缓冲液 4 倍至 5 倍，并将最终洗涤液过夜。
6. 将样品在 2 mL 二抗溶液（3% 正常血清/PTwH + 二抗/抗体）中于 37 °C 下孵育 5 天。2.5 天后刷新二抗溶液。
   1. 在二抗溶液中以 1：500 稀释二抗/抗体（即 4 μL 在 2 mL 中）。
7. 按照步骤 3.5 中的说明洗涤样品 1 天，将最后一次洗涤过夜。

4. 细胞核染色

注： 以温和的振荡方式进行所有孵育步骤，如果没有特别说明，则在室温下进行。保护样品避光。如果不需要核染色或需要噻唑红 （TO-PRO-3） 的激发波长/发射光谱来激发或检测另一个荧光团，请跳过此步骤。

1. 按照步骤 3.5 中的说明以 1：1,000 的比例稀释核酸染色剂 TO-PRO-3，并将样品在 4 mL 细胞核染色溶液中孵育 5 小时TAG_355 TAG_354 TAG_353 TAG_352 TAG_351 TAG_350。
   注：{{TAG_364洗涤后，样品可以储存在4°C的PBS中，直到光学透明化。

5. 组织透明化

注： 以温和的振荡进行所有孵育步骤，如果没有特别说明，则在室温下进行。保护样品避光。组织样品在一系列分级的 TBA 溶液中脱水。由于免疫染色需要水溶液，因此必须在组织透明化之前完成所有染色程序。光学清除率和折射率匹配是通过 BA、BB 和 DPE 的混合物处理来实现的。透明溶液补充有 DL-α-生育酚作为抗氧化剂。

1. 在蒸馏水中制备 30% （v/v）、50%、70%、80%、90% 和 96% TBA 溶液。例如，对于 30% TBA，将 15 mL 100% TBA 加入 35 mL 蒸馏水中，放入适当的可密封容器中，然后倒置混合。
   注：TBA 的熔点为 25–26 °C;因此，它在室温下往往是固体。要制备 TBA 溶液，请在培养箱或水浴中将密封良好的瓶子在 37 °C 下加热。
2. 用 4 mL 制备的 TBA 溶液系列的每种浓度的样品按升序脱水，每次脱水 2 小时。将 96% 的 TBA 放置过夜。
3. 将样品在纯 （100%） TBA 中进一步脱水 2 小时。
4. 制备澄清溶液 BABB-D15。
   注：BABB-D15 是 BA 和 BB （BABB） 的组合，它与 DPE 以 x：1 的比例混合，其中 x 在解决方案的名称中指定， 在本例中为 15.
   1. 对于 BABB，将单组分 BA 与两组分 BB 混合。
   2. 以 15：1 的比例混合 BABB 和 DPE。
   3. 添加 0.4 vol% DL-α-生育酚（维生素 E）。
      注：例如，对于 20 mL 的 BABB-D15，将 6.25 mL 的 BA 与 12.5 mL 的 BB 混合。加入 1.25 mL DPE 并补充 0.08 mL DL-α-生育酚。
5. 在透明溶液中清除样品，直到它们在光学上透明（2-6 小时）。
6. 样品可以在 4 °C 下避光储存在 BABB-D15 中，直到封固和成像。

6. 样品安装

1. 使用3D打印机打印成像室和盖子（材料：共聚酯[CPE]，喷嘴：0.25毫米，层高：0.06毫米，壁厚：0.88毫米，壁数：4，填充物：100%，无支撑结构）。
2. 组装成像室（图 1）。
   1. 用 RTV-1（单组分室温硫化）硅橡胶将圆形盖玻片（直径：30 mm）安装在成像室上。用水湿棉签去除多余的硅橡胶并固化过夜。
   2. 用 RTV-22 硅橡胶将圆形盖玻片（直径：1 mm）安装在盖子上。用水湿棉签去除多余的硅橡胶并固化过夜。
3. 将样品放入成像室中，加入少量 BABB-D15，然后盖上盖子。使用皮下注射针头 （27 G x 3/4 英寸 [0.40 mm x 20 mm]），通过入口将 BABB-D15 填充腔室。
4. 塞住入口并用 RTV-1 硅橡胶密封成像室。在黑暗中固化一夜。

7. 成像和图像处理

1. 通过选择相应的激光线来设置图像采集。调整每个检测器的检测范围，以防止通道之间的信号重叠。
   注： Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568 和 TO-PRO-3 的示例检测范围分别为 500-550 nm、590-620 nm 和 645-700 nm。
2. 选择采集参数，定义 z 堆栈的上下边界，然后获取图像堆栈。
   注： 示例采集参数是像素尺寸为 60-90 nm、z 步长为 0.5 μm、线平均值为 1、扫描速度为 400 Hz 和针孔尺寸为 1 艾里单位的序列扫描。
3. 使用适当的图像分析软件（例如 Fiji）处理图像堆栈，以生成 3D 投影或执行深入分析。
   注： 由于采集的图像文件体积较大，通常需要使用工作站。
   1. 在斐济打开采集或图像文件 （文件 | 开放 | 选择文件）。
      1. 例如，如果使用 LIF 文件，请在 Bio-Formats 对话框窗口中选择或取消选择所需的选项。使用 Hyperstack查看堆栈。除此之外，不需要特定的选择或刻度。按确定。
      2. 如果文件包含多个图片堆栈，请选择需要分析的图片，然后按 确定 确认。
   2. 通过将合并的图像分割成单独的通道来执行漂白校正 （图像 | 颜色 | 频道工具，然后选择更多 | 分割频道）。对于每个通道，选择漂白校正（图像，调整TAG_683 TAG_682 TAG_681，{{}}（}}漂白校正，并选择简单比例（背景强度： 0.0).
      注意：在某些情况下，例如，当信号没有线性衰减或信号整体太弱时，简单比率可能会失败。或者，试试指数拟合或跳过漂白剂修正。
   3. 使用滑块调整每个通道的亮度和对比度 （图像 | 调整 | 亮度 | 对比度）。
   4. 合并频道 （图片 | 颜色 | 合并频道），制作合成 （图像 |颜色 |{TAG_778}}频道工具， 然后选择更多 |制作合成），并将其转换为RGB格式（图像| 颜色|频道工具，然后选择更多，转换为RGB）。
   5. 如有需要，调整图像堆栈的大小以减少计算时间和文件大小 （图像 |调整 |{TAG_844}}大小， 两个选项都勾选了 plus bilinear interpolation）。
   6. 生成3D投影（图像|堆栈，3D项目）。选择 最亮点 作为投影方法，并设置切片间距以匹配获取的图像堆栈的 z 步长。为了获得最高质量，请将旋转角度增量设置为 1 并启用插值。根据需要修改总旋转、透明度阈值和不透明度。
   7. 如有需要，将3D投影转换回8位格式（图像） 键入| 8位）。使用相应的滑块 （图像 ， 调整 |亮度 |对比度） 并按照步骤 7.3.4 所述将图像堆栈重新转换为 RGB 格式。
   8. 将 3D 投影另存为 .TIF 文件（图像文件格式）和 .AVI 文件（视频文件格式）。

结果

材料