来源： Zaeck, L., et al. 溶剂清除脑组织中狂犬病病毒感染的高分辨率三维成像。J. Vis. Exp. (2019)。
本视频演示了制备和成像感染狂犬病病毒（RABV）的小鼠脑组织以评估感染进展的过程。内容概述了关键步骤，包括使用荧光标记对组织进行染色、脱水、透明化处理以及共聚焦激光扫描显微镜成像所需的封片操作，最终生成三维图像。
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小鼠脑组织中狂犬病病毒感染的三维可视化
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2025年5月29日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。
使用经狂犬病毒（RABV）感染且经多聚甲醛（PFA）固定的存档脑组织。
警告： 本方案使用多种有毒和/或有害物质，包括PFA、甲醇（MeOH）、过氧化氢（H₂O₂）2O2），叠氮化钠（NaN₃3), 叔丁基叔丁醇（TBA）、苯甲醇（BA）、苯甲酸苄酯（BB）和二苯醚（DPE）。甲醇（MeOH）和TBA高度易燃。应佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具），并在通风橱内进行实验，以避免接触。废弃物应使用合适的容器单独收集，并根据当地法规进行处理。狂犬病病毒被归类为生物安全等级（BSL）-2病原体，因此通常可在BSL-2条件下操作。某些操作，包括可能产生气溶胶的步骤、高浓度病毒操作或对新型丽沙病毒的操作，可能需要BSL-3等级的防护。建议对高风险人员（包括动物饲养人员和实验室工作人员）进行暴露前预防接种。请参照当地主管部门的规定。
1. 脑组织固定与切片
- 在4°C条件下，使用适量体积的4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS [pH 7.4]）固定脑组织样本，固定时间至少为48小时（组织与固定液体积比约为1:10 [v/v]）。
- 将组织样本在PBS中清洗3次，每次至少30分钟，并将其保存于含0.02% NaN3的PBS中，4°C保存备用。
- 使用振动切片机将组织切成厚度为1 mm的切片（刀片进给速率：0.3–0.5 mm/s，振幅：1 mm，切片厚度：1,000 µm）。
- 为保持切片顺序正确，将每一片组织单独存放于多孔细胞培养板的孔中。加入含0.02% NaN3的PBS，并于4°C保存组织切片以备后续使用。
2. 样品的甲醇预处理
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。避免样品暴露于光照。样品预处理的总体目的是通过甲醇（MeOH）和过氧化氢（H2O2）处理，以促进抗体渗透并降低组织自发荧光。
- 配制20% (v/v)、40%、60% 和 80% 的甲醇（MeOH）水溶液。例如，配制20% MeOH溶液时，取10 mL 100% MeOH加入40 mL去离子水中，置于合适的可密封容器中，通过倒置混匀。
- 将样品转移至合适大小的容器中（例如5 mL反应管）。注意使用对本方案中所用试剂具有化学耐受性的材料。例如，聚丙烯适用，而聚苯乙烯不适用。
注意：本方案中的体积参数均基于5 mL反应管。若使用其他容器，请相应调整体积。 - 将样品依次在4 mL各浓度的甲醇溶液中孵育，从低浓度到高浓度，每种浓度孵育1小时。
- 将样品在纯（100%）甲醇中孵育两次，每次1小时。
- 将样品冷却至4°C（例如，置于实验室安全冰箱中）。
- 配制漂白液（5% H2O2溶于MeOH），例如将30% H2O2储存液按1:6比例用纯（100%）MeOH稀释，并在4°C预冷。
- 从冷藏样品中移除100% MeOH，加入4 mL预冷的漂白液（5% H2O2溶于MeOH），在4°C孵育过夜。
- 将漂白液更换为4 mL 80% MeOH，孵育1小时。随后继续使用已配制的甲醇溶液系列，按浓度从高到低依次孵育，每种浓度1小时，直至样品在4 mL 20% MeOH中孵育1小时为止。
- 用4 mL PBS洗涤样品一次，每次1小时。
3. 免疫染色
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。避免样品暴露于光照。为防止微生物生长，将 NaN3 加入本节所用溶液中，终浓度为 0.02%。使用非离子型去污剂 Triton X-100 和 Tween 20 对组织样品进行进一步通透处理。采用正常血清以阻断抗体的非特异性结合。添加甘氨酸和肝素以降低免疫标记背景信号。
- 用 4 mL 的 0.2% Triton X-100/PBS 溶液清洗样本，每次 1 小时，共清洗 2 次。
- 在 37 °C 条件下，用 4 mL 的 0.2% Triton X-100/20% 二甲基亚砜（DMSO）/0.3 M 甘氨酸/PBS 溶液对样本进行透化处理，持续 2 天。
- 为阻断抗体的非特异性结合，在 37 °C 条件下，将样本在 4 mL 的 0.2% Triton X-100/10% DMSO/6% 正常血清/PBS 溶液中孵育 2 天。
注意：为获得理想的封闭效果，应使用与二抗来源相同的物种的正常血清。 - 在 37 °C 条件下，将样本在 2 mL 一抗溶液（3% 正常血清/5% DMSO/PTwH [含肝素的 PBS-Tween 20] + 一抗/抗体）中孵育 5 天。孵育 2.5 天后更换一抗溶液。
- 配制 PTwH 时，将肝素钠盐溶于蒸馏水中，配制成 10 mg/mL 的储存液（将此溶液分装后于 4 °C 保存）。将储存液加入 0.2% Tween 20/PBS 中，使其终浓度为 10 µg/mL。
注意：选择合适的一抗稀释比例可能需要优化。通常，标准免疫组织化学的浓度是一个良好的起始点。
- 配制 PTwH 时，将肝素钠盐溶于蒸馏水中，配制成 10 mg/mL 的储存液（将此溶液分装后于 4 °C 保存）。将储存液加入 0.2% Tween 20/PBS 中，使其终浓度为 10 µg/mL。
- 用 4 mL PTwH 溶液清洗样本 1 天，期间至少更换 4–5 次洗液，并将最后一次清洗液过夜保留。
- 在 37 °C 条件下，将样本在 2 mL 二抗溶液（3% 正常血清/PTwH + 二抗/抗体）中孵育 5 天。孵育 2.5 天后更换二抗溶液。
- 将二抗/抗体以 1:500 的比例稀释于二抗溶液中（即 2 mL 中加入 4 µL）。
- 按照步骤 3.5 所述方法清洗样本 1 天，最后一次清洗液过夜保留。
4. 细胞核染色
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非特别说明，均在室温下操作。避免样品暴露于光照下。若无需进行细胞核染色，或需使用硫代黄红（TO-PRO-3）的激发波长/发射光谱来激发或检测其他荧光染料，则可省略此步骤。
- 将核酸染料 TO-PRO-3 用 PTwH 溶液按 1:1,000 稀释，并将样品置于 4 mL 核染色液中孵育 5 小时。
- 按照步骤 3.5 所述方法清洗样品 1 天，最后一次清洗过夜。
注意： 清洗完成后，样品可在 4 °C 的 PBS 中保存，直至进行光学透明处理。
5. 组织透明化
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。样品需避光处理。组织样本通过梯度浓度的TBA溶液进行脱水。由于免疫染色需要在水相溶液中进行，因此所有染色步骤必须在组织透明化之前完成。光学透明化和折射率匹配通过BA、BB和DPE的混合液处理实现。透明化溶液中添加DL-α-tocopherol作为抗氧化剂。
- 用蒸馏水配制30% (v/v)、50%、70%、80%、90%和96%的TBA溶液。例如，配制30% TBA溶液时，将15 mL 100% TBA加入35 mL蒸馏水中，于适当的可密封容器中混合，通过倒置混匀。
注意：TBA的熔点为25–26 °C，因此在室温下通常呈固态。配制TBA溶液前，需将密封良好的瓶装TBA置于37 °C的培养箱或水浴中加热融化。 - 依次使用4 mL上述梯度浓度的TBA溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理2小时。96% TBA溶液中可过夜放置。
- 进一步用纯（100%）TBA对样品脱水2小时。
- 配制透明化溶液BABB-D15。
注意：BABB-D15是BA与BB（合称BABB）的混合物，再与DPE按 x:1的比例混合，其中 x 由溶液名称指定，本例中为15。- 配制BABB时，按1份BA与2份BB的比例混合。
- 将BABB与DPE按15:1的比例混合。
- 加入0.4 vol%的DL-α-生育酚（维生素E）。
例如，配制20 mL BABB-D15时，将6.25 mL BA与12.5 mL BB混合，加入1.25 mL DPE，并补充0.08 mL DL-α-生育酚。
- 将样品置于透明化溶液中处理，直至其呈现光学透明状态（2–6小时）。
- 样品可在BABB-D15溶液中于4 °C避光保存，直至进行封片和成像。
6. 样品封片
- 使用3D打印机打印成像室及其盖子（材料：共聚酯 [CPE]，喷嘴：0.25 mm，层高：0.06 mm，壁厚：0.88 mm，壁数：4，填充率：100%，无需支撑结构）。
- 组装成像室（图1）。
- 用单组分室温硫化（RTV-1）硅橡胶将圆形盖玻片（直径：30 mm）固定在成像室上。用蘸水的棉签去除多余的硅橡胶，并在室温下固化过夜。
- 用RTV-1硅橡胶将圆形盖玻片（直径：22 mm）固定在盖子上。用蘸水的棉签去除多余的硅橡胶，并在室温下固化过夜。
- 将样品放入成像室，加入少量BABB-D15，然后插入盖子。通过入口使用皮下注射针头（27 G × 3/4 英寸 [0.40 mm × 20 mm]）将BABB-D15充满整个腔室。
- 堵住入口，并用RTV-1硅橡胶密封成像室。在避光条件下过夜固化。
7. 成像与图像处理
- 通过选择与所用荧光染料相匹配的激光谱线来设置图像采集参数。调整每个检测器的检测范围，以防止不同通道之间的信号重叠。
注意： Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568 和 TO-PRO-3 的典型检测范围分别为 500–550 nm、590–620 nm 和 645–700 nm。 - 选择采集参数，定义 z 轴堆栈的上下边界，并采集图像堆栈。
注意： 典型的采集参数包括：逐帧扫描，像素大小为 60–90 nm，z 轴步长为 0.5 µm，线平均次数为 1，扫描速度为 400 Hz，针孔大小为 1 阿贝单位。 - 使用适当的图像分析软件（例如 Fiji）处理图像堆栈，以生成三维投影或进行深入分析。
注意： 由于采集的图像文件体积较大，通常需要使用工作站进行处理。- 在 Fiji 中打开采集或图像文件（文件 | 打开 | 选择文件）。
- 若使用 LIF 文件，请在 Bio-Formats 对话框中选择或取消选择所需选项。使用 超堆栈 查看堆栈。除此之外，无需进行其他特定选择或勾选。点击 确定。
- 如果文件包含多个图像堆栈，请选择需要分析的堆栈，并点击 确定 确认。
- 通过将合并的图像拆分为各个通道（图像 | 颜色 | 通道工具，然后选择 更多 | 拆分通道）进行漂白校正。对每个通道，选择漂白校正（图像 | 调整 | 漂白校正），并选择 简单比率法（背景强度：0.0）。
注意：在某些情况下，例如信号无线性衰减或整体信号过弱时，简单比率法 可能失效。此时可尝试 指数拟合法 或跳过漂白校正步骤。 - 使用滑块调整每个通道的亮度和对比度（图像 | 调整 | 亮度 | 对比度）。
- 合并通道（图像 | 颜色 | 合并通道），生成复合图像（图像 | 颜色 | 通道工具，然后选择 更多 | 生成复合图像），并将其转换为 RGB 格式（图像 | 颜色 | 通道工具，然后选择 更多 | 转换为 RGB）。
- 如有必要，调整图像堆栈大小以减少计算时间和文件体积（图像 | 调整 | 大小，勾选两个选项并使用双线性插值）。
- 生成三维投影（图像 | 堆栈 | 3D 投影）。选择 最亮点 作为投影方法，并将切片间距设置为与采集图像堆栈的 z 轴步长一致。为获得最高质量，将旋转角度增量设为 1，并启用插值。根据需要调整总旋转角度、透明度阈值和不透明度。
- 如有必要，将三维投影转换回 8 位格式以重新调整对比度和亮度（图像 | 类型 | 8 位）。使用相应的滑块（图像 | 调整 | 亮度 | 对比度）调整后，按照步骤 7.3.4 所述将图像堆栈重新转换为 RGB 格式。
- 将三维投影保存为 .TIF 文件（图像文件格式）和 .AVI 文件（视频文件格式）。
- 在 Fiji 中打开采集或图像文件（文件 | 打开 | 选择文件）。
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结果
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 苯甲醇 | |||
| 苯甲酸苄酯 | |||
| 二甲基亚砜 | |||
| 二苯醚 | |||
| DL-α-生育酚 | |||
| 驴血清 | |||
| 甘氨酸 | |||
| 山羊血清 | |||
| 肝素钠盐 | |||
| 过氧化氢溶液（30 %） | |||
| 甲醇 | |||
| 多聚甲醛 | |||
| 叠氮化钠 | |||
| 叔丁醇 | |||
| TO-PRO-3 | |||
| Triton X-100 | |||
| Tween 20 | |||
| 其他 | |||
| 5 mL 离心管 | |||
| 盖玻片，圆形（直径：22 mm） | |||
| 盖玻片，圆形（直径：30 mm） | |||
| 皮下注射针头（27 G × ¾[0.40 mm × 20 mm] | |||
| RTV-1硅橡胶 | |||
| Ultimaker CPE 2.85 mm 透明 | |||
| 技术设备与软件 | |||
| 3D打印机 | |||
| 自动水浸系统 | |||
| 台式轨道摇床 | |||
| 加热型台式轨道摇床 | |||
| 共聚焦激光扫描显微镜 | |||
| Fiji | |||
| 长工作距离水浸物镜 | |||
| 振动切片机 | |||
| 工作台 | |||
| 一抗 | |||
| 山羊抗RABV N | |||
| 兔抗 GFAP | |||
| 兔抗 MAP2 | |||
| 兔抗 RABV P 160-5 | |||
| 二抗 | |||
| 驴抗山羊IgG | |||
| 驴抗小鼠 IgG | |||
| 驴抗兔 IgG | |||
| 山羊抗小鼠 IgG | |||
| 山羊抗兔 IgG | |||
