利用光谱反射法测定固定小鼠脑切片中有髓轴突的直径

摘要

来源： Kwon, J., et al.，原位髓鞘化轴突的光谱反射显微技术。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用高光谱共聚焦显微镜进行光谱反射率分析，以检测干涉图样并测定固定脑组织切片中有髓神经轴突的直径。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 校准

1. 在成像前至少1小时开启显微镜，以使激光光源达到热稳定状态（参见材料表）。然后启动光谱扫描软件（参见材料表），并点击图形用户界面（GUI）顶部的“采集”按钮（图1a）。
2. 打开白光激光器（WLL）和光电倍增管（PMT）的软件快门（图1a）。
3. 在“采集模式”下拉菜单中选择xyΛ模式，此时激光输入模式将自动从“恒定百分比”切换为“恒定功率”。取消勾选“自动SP移动”复选框。然后在Λ-激发光谱扫描设置中将输入激光的光谱范围设为470–670 nm，光谱步长设为4 nm（图1b）。
4. 通过双击或拖动光谱范围调节条，将PMT的光谱范围设置为450–690 nm（图1c）。
   注意：该光谱范围应包含输入光源的完整带宽。
5. 选择一个水浸物镜，建议使用高数值孔径（NA > 0.7）的物镜，并为PMT和激光功率设置任意值以激活AOBS（声光偏转器）配置和“实时扫描”按钮。通过在AOBS配置中勾选反射选项来切换光路（图1d）。
6. 将参考镜（参见材料表）安装到显微镜载物台上，镜面应朝向物镜。若难以直接安装，可将镜片粘附于平整基板上（例如，载玻片）。
7. 调节显微镜载物台，使焦平面与镜面重合。
8. 根据探测器的动态范围调节PMT增益和激光功率，然后将激光输入模式从“恒定百分比”切换为“恒定功率”。
   注意：通常在570 nm处使用500 V的PMT增益和0.1%的相对激光功率。
9. 以伪彩色模式确认在整个波长范围内无信号饱和。若观察到饱和现象，请降低激光功率（图1a）。
10. 运行Lambda扫描采集。
11. 从载物台上移除镜片，并在无样品条件下重复相同采集，以获得暗参考信号（即，暗偏移）。
12. 将数据保存为多层堆叠TIF格式。

2. SpeRe （光谱反射测量法）图像采集

1. 将固定好的组织置于显微镜载物台上。通过目镜使用宽场荧光模式，大致将组织与物镜的焦平面进行对齐。
2. 开启 实时扫描（Live Scan），调节显微镜载物台，使焦平面与组织中的目标区域对齐。为避免盖玻片带来的背景噪声，应选择距玻璃-组织界面至少 15 μm 深度的目标区域。
3. 使用与步骤 1.1–1.10 中所述相同的方法，对目标区域采集光谱图像堆栈。
4. 将组织数据和暗偏移数据以 多层堆叠 TIF（Multistacked TIF） 格式保存。
   注意： 实验人员可在该阶段暂停操作。

3. 图像处理与分析

1. 在 ImageJ 中打开参考镜和脑组织的光谱数据（多层堆叠 TIF 文件）。
2. 为已打开的图像堆叠选择感兴趣区域（ROI）——参考镜选择中心区域，脑组织选择一段轴突纤维区域。
3. 在 ImageJ 菜单中执行 图像 → 堆叠 → 绘制 Z 轴轮廓，获取所选 ROI 的原始光谱。
4. 打开暗偏移数据，分别获取参考镜和脑组织的暗偏移数据。
5. 在 ImageJ 菜单中执行 图像 → 堆叠 → 绘制 Z 轴轮廓，获取暗偏移的光谱。
6. 使用 复制和粘贴 功能保存所有获取的光谱。
   注意： 对于 SpeRe 成像，建议使用成像视野中心区域，以最小化离轴光学像差。轴突纤维在其长度方向上可能存在结构异质性。因此，建议在较小的轴突段上选择 ROI，通常小于 < 5 µm，以最小化部分容积伪影。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
复消色差物镜 40×，数值孔径 1.1	徕卡显微系统	15506357	水浸式物镜。
Fluoromyelin Green	赛默飞世尔科技	F34651
Leica SP8 TCS 显微镜	徕卡显微系统	SP8
成像软件	徕卡显微系统	LAS-X
Matlab	MathWorks
反射镜	Thorlabs	PF10-03-P01	镀有保护银层。
盖玻片	赛默飞世尔科技	3306	厚度：#1（0.13 至 0.17 mm）。
载玻片	Muto Pure Chemicals	5116-20F	厚度：约 1 mm。
瞬间胶	汉高	Loctite 406	使用分配设备以避免接触皮肤或眼睛。
白光激光器	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 已停产，由 EXU-6 取代。