使用光片荧光显微镜可视化运动神经元投影和轴突分支

摘要

来源： 廖东 et al. 使用光片荧光显微镜观察小鼠胚胎中运动轴突导航和轴突树枝化的量化。J. Vis. Exp. （2018）.

该视频演示了使用光片荧光显微镜对转基因小鼠胚胎中的运动神经元投射和轴突分支进行成像。它概述了样本制备、成像和轴突分支的 3D 重建所涉及的步骤，用于评估运动神经元的生长和连接。

方案

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所有涉及动物样本的程序均已经过适当的动物伦理审查和批准审查委员会。

1.光片荧光显微镜 （LSFM） （2–3 h）

1. 示例设置
   1. 设置 5X/0.1 照明光学器件和 5X/0.16 检测光学器件。组装样品架和样品毛细管（1.5 mm 内径，绿色）并将它们放入显微镜中。
      注意：
   2. 准备 P200 移液器吸头，切掉上部，使其适合毛细管的直径，并去除用于样品附件的尖头部分 （~ 3 mm）。
   3. 找到 找到 sample图 1B图像采集
      1. 在获取 注意：连续注意：STOP 结束图像采集。
   4. 多维采集
      1. 通过移动第一个和最后一个图像的 Z 位置来定义 z 堆栈。单击 最佳 设置切片编号。
      2. 开始实验以获取选定的 z 堆栈。
      3. 图像处理（可选）
         1. 继续执行 双侧融合 在 Lightsheet 处理通道（如果应用了双面照明）。多视图处理。
         2. 最大强度投影Copy子集从原始集中选择图像子集。

      2.轴突树枝化的量化（每条神经 30 分钟）

      1. 在成像分析软件中打开图像文件（默认情况下，包含 XYZ 数据的图像以 Surpass 模式和 3D 渲染视图打开）。
      2. 显示调整window （编辑 |显示显示调整） 以根据局部强度对比检测细丝。
      3. 添加新细丝自动路径（无循环）算法。
      4. 下一步完成后。
      5. 切片 导航 |选择），然后选择Shift + 右键单击在兴趣点。
      6. 导航 |选择），然后Shift + 左键单击在兴趣点上手动添加或删除种子点。
         注意：删除起点周围的种子点。
      7. 删除断开连接的段 最大间隙长度 以定义排除。
      8. 近似横截面积算法。
      9. Properties 以仅查看重建的轴突。
      10. 统计信息下Detailed。使用 filament No.树突末端点量化运动神经末梢作为运动轴突树枝化的指标。
          注意：统计如果需要，可以添加 Annotation。

结果

材料