使用光片荧光显微镜观察运动神经元投射及轴突分支

摘要

来源： Liau, E. S. et al. 利用光片荧光显微镜对小鼠胚胎中运动轴突导向的可视化及轴突分支的定量分析。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了利用光片荧光显微镜对转基因小鼠胚胎中的运动神经元投射及轴突分支进行成像的方法。视频概述了样本制备、成像以及轴突分支三维重建的各个步骤，用于评估运动神经元的生长与连接性。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 光片荧光显微镜技术（LSFM）（2–3 小时）

1. 样品设置
   1. 设置 5X/0.1 照明光学系统和 5X/0.16 检测光学系统。组装样品支架和样品毛细管（内径 1.5 mm，绿色），并将其放入显微镜中。
      注意： 有关详细设置步骤，请参阅显微镜的操作手册。
   2. 按以下步骤安装胚胎：
      1. 准备 P200 移液器吸头，切去上部，使其适配毛细管的直径，并去除尖端部分（约 3 mm），以便固定样品。
      2. 用小火焰熔化移液器吸头的钝端。
      3. 熄灭火焰，并迅速将胚胎垂直固定在熔化的末端上。
      4. 将移液器吸头的上部与样品毛细管连接。
   3. 让腔室缓冲液与胚胎平衡 1 分钟，以清除碎片或气泡。
   4. 使用成像软件，在 定位 选项卡下选择 定位毛细管，并调节 x、y 和 z 轴，以定位样品毛细管。
   5. 选择 定位样品，并将放大倍数调至 0.6X 以聚焦胚胎。旋转胚胎，确保成像肢体的长轴与两个光源的光路对齐（图 1B）。
2. 图像采集
   1. 在 采集 选项卡下，定义光路参数，如检测物镜、激光阻挡滤光片、分光镜、相机和激光器。
      注意： 本实验使用绿色荧光蛋白（GFP）通道（激发波长：488 nm；发射滤光片：带通（BP）505 至 545 nm；分光镜：SPS LP 560）。
   2. 勾选“枢轴扫描”复选框以减少阴影。
   3. 定义采集设置：位深度，16 位；放大倍数，0.36–0.7X；单侧照明（左/右）或双侧照明。
   4. 点击 连续，并设置激光强度、曝光时间、激光功率和光片位置，以获取更清晰的图像。
      注意： 激光功率应尽可能保持在最低水平，以最小化光损伤。
   5. 按下 停止 以结束图像采集。
3. 多维采集
   1. 通过移动第一张和最后一张图像的 Z 位置来定义 z 轴堆栈。点击 最佳 以设置切片数量。
   2. 点击 开始实验 以采集选定的 z 轴堆栈。
   3. 完成后，将图像保存为 .czi 格式。
4. 图像处理（可选）
   1. 若采用双侧照明，请在 Lightsheet Processing 通道下进行 双侧融合。若采集了多视角图像，则需进行 多视角处理，以合并来自多个角度的图像。
   2. 在 最大强度投影 通道下，使用投影轴上最高强度像素的数据创建 2D 图像。
   3. 在 复制 通道下，点击 子集 以从原始图像集中选择子集。

2. 轴突分支的定量分析（每条神经约需30分钟）

1. 在成像分析软件中打开图像文件（默认情况下，包含 XYZ 数据的图像将以 Surpass 模式打开，并以 3D 渲染视图显示）。
2. 使用 Display Adjustment 窗口（Edit | Show Display Adjustment）调整图像的颜色、亮度和对比度，以基于局部强度对比检测纤维结构。
3. 点击 Add New Filaments 图标，并在下拉菜单中选择 Autopath (no loop) 算法。
4. 选择感兴趣区域（本例中为待分割的目标轴突）。完成后点击 Next 。
5. 通过设定最大和最小直径测量值来定义起始点和种子点，这些测量值可使用 Slice 模式进行测定。
6. 在感兴趣区域的边缘设定一个起始点。若需手动添加或删除起始点，首先更改指针模式（Navigate | Select），然后在目标位置 Shift + 右键单击。
7. 手动设定种子点的阈值，以确保所有可见的分支结构均被标记。更改指针模式（Navigate | Select），然后在目标位置 Shift + 左键单击，以手动添加或删除种子点。
   注意： 必须手动去除背景噪声以及邻近神经的信号干扰。
8. 勾选 Remove seed points around starting points 选项。
9. 勾选 Remove disconnected segments ，以排除距离过远、可能代表背景噪声的点。在下一步中指定 Maximum Gap Length ，以定义排除的上限值。
10. 调整背景减除的阈值，该阈值使用高斯滤波器估算每个体素的背景强度。
11. 使用 Approximate cross-section area 算法，自动设定树突直径的阈值。
12. 跳过树突棘计算的相关步骤。
13. 完成处理，并选择所需的样式和颜色。
14. 在 Properties 中取消勾选体积框，仅显示重建后的轴突。
15. 在 Statistics 选项卡下选择 Detailed。使用 Filament No. Dendrite Terminal Points 对运动神经末梢进行定量，作为运动轴突分支的指标。
    注意： 如有需要，可添加统计学标注。
16. 将重建轴突的图像导出为 .tif 文件。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hb9::GFP	杰克逊实验室	005029	收集胚胎发育第13.5天（E13.5）的胚胎
4% 多聚甲醛（PFA）			配制200ml：加入20ml 10X PBS、8g PFA于双蒸水中，用NaOH（10N）调节pH至7.4，过滤除菌后于-20 °C保存。
10X 磷酸盐缓冲液（PBS 10X）			配制1L：加入80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g 磷酸氢二钠、2.4 g 磷酸二氢钾，用双蒸水定容，高压灭菌后室温保存。
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
胎牛血清	ThermoFisher	26140079
羊多克隆抗-GFP抗体	AbD Serotec	4745-1051	1:1000
Alexa Fluor 488 驴抗羊抗体	Invitrogen	A-11015	1:1000
RapiClear 1.47 透明化试剂	SunJin Lab	RC147001
1.5ml 微量离心管	Sarstedt	72.690.001
24孔板	ThermoFisher	142475
5 SA 镊子	ideal-tek	3480641
直头尖/尖眼科剪	Aesculap	BC110R
显微外科手术刀片，一次性使用	Aesculap	BA365
解剖显微镜	Nikon	SMZ800
摇床	TKS	RS-01
Lightsheet Z.1 显微镜	Carl Zeiss Microscopy
Imaris 8.4.0 图像分析软件	Bitplane, Zurich, Switzerland
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J（Hb9::GFP 小鼠）	杰克逊实验室	005029