扁平化脑切片中皮层模块的组织化学成像

本文内容

摘要

本视频展示了一种利用组织化学染色方法在展平的大脑切片中可视化皮层模块的技术。经预先固定的脑切片用染色试剂处理，该试剂可突出显示活跃的神经元簇，形成深色、高对比度的区域。经过封片和脱水处理后，在明场显微镜下可观察到皮层模块呈现为深色、斑块状的图样。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 利用细胞色素氧化酶染色法观察皮层功能模块

注意： 针对细胞色素氧化酶活性的组织化学检测，已开发出多种不同的染色方案。本方案采用硫酸镍铵（NiAS），可在染色的皮层区域中获得更高的对比度和更清晰定义的功能模块。

配制细胞色素氧化酶染色液。每10 mL溶液，加入10 mL 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（0.1 M，pH 7.4）、400 mg蔗糖、12.5 mg NiAS、2 mg细胞色素C和6 mg二氨基联苯胺（DAB）。
注意： DAB和NiAS具有致癌性。
备注： DAB应在切片孵育前立即加入。
在摇床上用HEPES缓冲液（0.1 M，pH 7.4）清洗切片15分钟。
将切片置于染色液中，在室温下于摇床上孵育。
备注： 观察染色速度。若无明显反应，可改为37 °C孵育。根据固定程度不同，染色可在10分钟后或数小时内观察到。
加入4%多聚甲醛（PFA）终止反应；此举可防止非特异性再染色及背景信号增强。
用HEPES缓冲液清洗切片三次，每次10分钟。
将切片封固于载玻片上并干燥。
用梯度乙醇脱水：
1. 将载玻片依次在60%乙醇中清洗1分钟、80%乙醇中清洗1分钟、96%乙醇中清洗2分钟、100%乙醇中清洗3分钟、异丙醇中清洗5分钟、二甲苯中清洗5分钟。
立即加入快速硬化封片介质，并加盖盖玻片。 关键步骤： 不可使用水性封片介质，否则NiAS会被洗脱，导致染色降解。
将切片于4 °C长期保存。

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材料

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