利用流式细胞术分析小鼠神经系统组织中的免疫细胞

摘要

来源： Hidmark, A. S., 等. 利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞. J. Vis. Exp. (2017).

本视频展示了如何使用流式细胞术分析小鼠坐骨神经和背根神经节（DRGs）中的免疫细胞。该过程包括用荧光素和生物素标记的抗体对免疫细胞进行标记，固定并通透细胞，以及利用荧光标记物检测细胞表面和细胞核的特征。该技术可实现对神经组织中免疫细胞异质性的定量评估。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 坐骨神经和背根神经节的消化

1. 配制消化液（杜氏改良伊格尔培养基 [DMEM]、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 [HEPES]、5 mg/mL 牛血清白蛋白 [BSA]、1.6 mg/mL IV 型胶原酶），并补充 100 µg/mL 脱氧核糖核酸酶，置于冰上保存。
   注意： 每只小鼠（坐骨神经 + 背根神经节）所需消化液体积为 1 mL。配制后，消化液可分装并储存于 -20 °C。
2. 将一只小鼠的坐骨神经和背根神经节分别转移至含有 500 µL 消化液的 1.5 mL 离心管中。对于坐骨神经，使用弹簧剪将其剪成 15–20 段，然后在 37 °C 摇床培养箱中以轻柔振荡（≤ 450 rpm）孵育组织悬液 20 分钟。
3. 使用 1,000 µL 移液枪头反复吹打细胞悬液，以机械方式解离未完全消化的组织。
   注意： 若悬液难以吹打，可用剪刀剪去移液枪头尖端以形成钝口。将组织悬液在 37 °C 下以轻柔振荡（≤ 450 rpm）继续孵育 20 分钟。
4. 再次使用 1,000 µL 移液枪头反复吹打，并在 37 °C 下以轻柔振荡（≤ 450 rpm）继续孵育 10 分钟。
5. 配制 FACS 缓冲液（含 10% 胎牛血清 [FCS] 和 1 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA] 的磷酸盐缓冲液 [PBS]），置于冰上保存。将孔径为 140 µm 的不锈钢筛网用 FACS 缓冲液润洗并浸泡于冰上的 60 × 15 mm 培养皿中。
   注意： 应避免使用尼龙筛网滤器，因其会导致有核细胞得率显著降低。
6. 将组织悬液置于冰上，用钝头镊夹持 140 µm 筛网滤器，反复使悬液通过筛网。从培养皿中收集细胞悬液，并转移至另一置于冰上的 1.5 mL 离心管中。
7. 使用 1,000 µL 移液枪头反复吹打，将残留在滤器上的未完全消化的组织推过筛网。用 500 µL FACS 缓冲液冲洗筛网滤器两次，并将所得细胞悬液收集至培养皿中，与步骤 1.6 的细胞悬液合并。
   注意： 若所用流式细胞仪对碎片敏感，可将步骤 1.7 的细胞悬液通过 70 µm 筛网滤器；但此举可能导致有核细胞得率降低。
8. 将细胞悬液在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中。重复此洗涤步骤一次。
9. 根据所需染色数量，将细胞沉淀重悬于 150–350 µL FACS 缓冲液中（每种染色方案需 150 µL FACS 缓冲液）。

2. 坐骨神经和背根神经节的荧光标记抗体染色用于流式细胞术

1. 将100 µL坐骨神经或背根神经节（DRG）细胞悬液转移至置于冰上的96孔板的V型孔中。
   注意：所有使用的抗体均需设置单染细胞，因其可为流式细胞术的光电倍增管（PMT）电压增益和补偿设置提供必要的对照，并有助于区分特异性结合与非特异性结合。
2. 将来自坐骨神经或DRG样本的剩余细胞悬液（每样本约50 µL）合并，作为未染色对照。
3. 在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。将板倒置于废液容器上，快速甩动以去除上清液，并在纸巾上轻拍干燥。
4. 进行表面染色时，将各孔中的细胞沉淀重悬于20 µL含目标抗体（CD45-A647、CD11b-PerCP/Cy5.5和主要组织相容性复合体[MHC] II类-Biotin）的FACS缓冲液中，在冰上避光孵育30分钟。
   注意：（1）最佳抗体稀释度应在使用前根据生产商的产品信息通过系列稀释实验确定；（2）在此步骤中可根据生产商说明加入Fc阻断剂以减少非特异性染色；（3）当使用直接偶联荧光染料的一抗或目标抗原可产生明显分群时，通常无需设置同型对照染色。
5. 向每孔中加入130 µL FACS缓冲液，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。按前述方法（步骤2.3）弃去上清液，并用150 µL FACS缓冲液将细胞沉淀洗涤两次。
   注意：若使用未偶联一抗或生物素偶联一抗，则可在此步骤加入适当的荧光偶联二抗试剂，并重复步骤2.4–2.5。在本方案中，分别使用链霉亲和素-PE/Cy7或链霉亲和素-PerCP检测MHC II类，与CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5组合，或与CD68-APC和F4/80-PE/Cy7组合。
6. 固定时，在最后一次洗涤步骤后，将细胞沉淀重悬于100 µL含4%多聚甲醛的PBS（pH 7.4）中。在冰上孵育10分钟，然后在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。按前述方法（步骤2.3）弃去上清液，并用150 µL FACS缓冲液洗涤细胞沉淀一次。
   注意：多聚甲醛有毒；操作时应佩戴适当防护装备，如手套、护目镜等。等。
   注意：将细胞沉淀重悬于150 µL FACS缓冲液中，避光保存于4 °C，最多可保存两天。若无需进行胞内染色，则在4 °C条件下以400 × g离心5分钟后，直接进入步骤2.11。
7. 进行胞内染色时，将细胞沉淀重悬于150 µL含0.5%去垢剂的FACS缓冲液中，在室温避光孵育15分钟。在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。按前述方法（步骤2.3）弃去上清液，并用150 µL含0.5%去垢剂的FACS缓冲液洗涤细胞沉淀一次。将细胞沉淀重悬于20 µL含目标抗体（CD68-APC、CD206-PE）的含0.5%去垢剂的FACS缓冲液中，在室温避光孵育30分钟。
8. 向每孔中加入130 µL含0.5%去垢剂的FACS缓冲液，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。按前述方法（步骤2.3）弃去上清液，并用150 µL含0.5%去垢剂的FACS缓冲液将细胞沉淀洗涤两次。
   注意：若使用未偶联一抗或生物素偶联一抗，则可在此步骤加入适当的荧光偶联二抗试剂，并重复步骤2.9–2.10。
9. 将细胞沉淀重悬于150 µL含0.5%去垢剂的FACS缓冲液中，避光保存于4 °C，最多可保存两天。
10. 将细胞沉淀重悬于150 µL含0.5%去垢剂的FACS缓冲液中，并补充5 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），在室温避光孵育5分钟。在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。按前述方法（步骤2.3）弃去上清液。
11. 将细胞沉淀重悬于150 µL PBS中，并转移至适当标记的FACs管中。避光保存于室温，待分析时使用。
    注意：重悬于PBS后，应在数小时内完成细胞分析，因为DAPI会缓慢从DNA上解离，导致信号减弱。

3. 流式细胞术的设置与样本检测

1. 确保流式细胞仪配备了适当的激光器和/或滤光片组，以检测用于染色细胞的荧光染料。该配置可在系统默认的细胞仪设置下确定。在本方案中，使用配备三种激光器（405 nm、488 nm 和 633 nm）的流式细胞仪对细胞进行分析，可检测 ≤ 5 种荧光染料。
2. 选择用于检测目标荧光染料的合适通道。所有荧光信号均宜采用对数放大模式进行检测。
3. 为样本选择合适的流速。该参数可能因所用系统而异，需通过实验经验确定。在本方案中，采用中至高流速（MED-to-HI，35–60 µL/min）以防止进样针堵塞。
4. 设定每个样本需采集的总事件数/细胞数。事件数最低应为 1,000,000。
5. 在全局工作表中创建侧向散射面积（SSC-A）与前向散射面积（FSC-A）的散点图，以及每种目标荧光染料与FSC-A的散点图。创建一个统计视图，用于显示所选荧光染料的事件数量和平均荧光强度（MFI）。
6. 设置FSC-A和SSC-A通道的电压，使最小的细胞位于散点图左下角10%的区域内。通过坐骨神经或背根神经节（DRG）的未染色对照样本确定背景荧光和最低样本荧光。根据仅用DAPI染色的对照样本的散点图确定父代（P1）门控。
   注意：此门控并非用于采集，部分原因是外周神经系统（PNS）中DAPI+细胞群体具有异质性。
7. 利用每种目标荧光染料的FSC散点图，调节电压，使未染色对照样本的细胞落在各自散点图的下四分之一区域内。然后在该区域上方创建门控，以界定各标记物/荧光染料阳性的细胞。通过运行单染对照样本（步骤2.1）确认门控位置。
   注意：可在当前步骤进行发射光谱重叠的补偿校正，也可在后续使用适当的分析软件进行回溯性补偿。
8. 按照上述方法完成流式细胞仪设置后，即可开始运行样本。
9. 运行结束后，剩余样本材料可予以丢弃，FCS文件可导出用于进一步分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6 小鼠	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM（含1 g/L葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸）	Thermo	31885023	该材料的来源不重要
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2153
IV型胶原酶（Collagenase Type 4）	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶（DNase）I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich	E6758
胎牛血清（FCS），热灭活	Sigma-Aldrich	F4135
抗CD11b-PerCP/Cy5.5抗体	Biolegend	101228	克隆号 M1/70
抗MHC II类分子生物素标记抗体	Biolegend	107603	克隆号 M5/114.15.2
抗CD45-A647抗体	Biolegend	107603	克隆号 30-F11
链霉亲和素-PE/Cy7	Biolegend	405206	用于与CD45-A647和CD11b-PerCP/Cy5.5联合检测MHCII-生物素
链霉亲和素-PerCP	Biolegend	405213	用于与CD68-APC和F4/80-PE/Cy7联合检测MHCII-生物素
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	用PBS稀释至50倍，避光保存于4 °C
细胞分离筛-组织研磨试剂盒	Sigma-Aldrich	CD1
V型96孔板	Greiner/Sigma	M8185
5 ml 聚苯乙烯圆底管，12×75 mm	BD Biosciences	352008
60×15 mm 培养皿	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II 流式细胞仪	BD Biosciences