使用光学相干断层扫描技术对小鼠视网膜进行活体成像

摘要

来源： Jagodzinska, J., et. al.，活体小鼠视网膜神经节细胞的光学相干断层扫描成像。 J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们演示了使用谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对视网膜各层进行成像，并评估视神经病变基因修饰小鼠模型中的结构变化。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会以及 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 小鼠准备

1. 瞳孔散大与固定
   1. 在数据采集前至少15分钟，向小鼠眼内滴入10%去氧肾上腺素滴眼液，去除多余液体后，再滴入0.5%托吡卡胺滴眼液。
      注意：首次散瞳可一次性对所有即将参与实验的小鼠完成。确保液体处于室温。
   2. 在实施全身麻醉后（步骤1.2），立即滴入0.4%盐酸奥布卡因滴眼液，保持3秒以麻醉并固定眼球。随后擦去滴眼液，并重复滴入10%去氧肾上腺素和0.5%托吡卡胺，以确保瞳孔充分散大。
      注意：确保液体处于室温，并防止小鼠吞咽奥布卡因。
2. 全身麻醉
   1. 配制氯胺酮（20 mg/mL）和赛拉嗪（1.17 mg/mL）的生理盐水麻醉溶液。4 °C下保存，最长不超过2周。
   2. 测试前约5分钟，根据小鼠的年龄和体型，按每克体重5–10 µL的剂量腹腔注射麻醉液。
      注意： 幼龄和/或体型瘦小的小鼠所需麻醉剂量较少，麻醉起效更快，但也苏醒更迅速。此处使用8 µL/g（即氯胺酮160 mg/kg，赛拉嗪9.33 mg/kg）。
   3. 可选：使用黏稠滴眼液或眼用凝胶润滑眼球，以防止角膜干燥。

2. 小鼠定位

1. 使用粘稠的甘醇基滴眼液润滑眼睛，以提供角膜水合作用。
   注意：若检查过程中眼睛显得干燥，需重新滴加滴眼液。
2. 用一块外科纱布包裹小鼠，以保持其体温。
3. 使用海绵或棉芯，在每只眼睛上涂抹一层含0.3%羟丙基甲基纤维素的眼用凝胶，以减少光线折射、避免混浊，并维持角膜水合作用。操作时，将眼睫毛和胡须拨开。
4. 将小鼠放入样品架中，头部保持正直并朝向前方。
5. 轻轻打开咬合杆夹具，将咬合杆放入小鼠口中，并使用鼻带固定其位置。
   注意： 确保咬合杆位于样品架的中央位置。
6. 若正在检测右眼（左眼），则在右侧（左侧）下方放置一个棉卷。
7. 在保持夹式对准头位于小鼠专用镜头上的同时，通过逆时针旋转Z轴调节螺钉，将对准头向眼睛方向移动。
8. 通过旋转和摆动样品架，并调节咬合杆及X轴调节螺钉，预先设定小鼠的位置；目标是使右眼正对镜头，从而对齐眼睛与镜头的光轴。
   注意： 若小鼠位置过高或过低，应首先使用Y轴调节螺钉进行调整。
9. 在“Exam”中选择第一个扫描，点击“Start Aiming”，并对视网膜成像进行进一步的手动调整。
   1. 使用Z轴调节螺钉，在左侧面板上垂直移动视网膜（图1，水平B扫描对齐），并在右侧面板上水平移动视网膜（图1，垂直B扫描对齐）。
   2. 旋转样品架，通过上下移动视盘（ONH）使其位于右侧面板中央；使用咬合杆螺钉使右侧面板上的视网膜保持平直；摆动样品架，使视盘位于左侧面板中央。
   3. 使用X轴调节螺钉使左侧面板上的视网膜保持水平。在明确各调节装置主要功能的基础上，进一步调整视网膜位置，使视盘居中。
      注意： 如有必要，可使用Y轴调节螺钉在右侧面板上上下移动视盘。可在每次扫描之间随时对位置进行精细调整。

3. 视神经乳头和视网膜的谱域光学相干断层成像（SD-OCT）

1. 确认调整无误后，点击“开始快照”以启动 SD-OCT 扫描。
   1. 若无需进行三维成像，请取消勾选 OCU 选项。
2. 保存扫描图像和报告。
3. 继续进行下一次扫描。
4. 如需对第二只眼成像，在撤回镜头后，相应地旋转盒式组件，并重复步骤 2.6 至 3.3。

4. 采集完成

1. 采集完成后，将小鼠从样品架中取出，每只眼睛滴加含0.3%羟丙基甲基纤维素的眼用凝胶，并将小鼠置于加热板上使其苏醒。
2. 最后一次采集结束后，关闭软件，并关闭计算机和OCT仪器（电源按钮）。
3. 使用消毒剂清洁样品架。

5. 分析

1. 进行视网膜层厚度测量时，使用制造商提供的自动分割软件。
   1. 点击“患者”（Patient），从列表中选择所需的“检查”（Exam），然后点击“查看检查”（Review Exam）选项。
   2. 通过在所需扫描图像上右键点击文件夹图标，将所需的OCT数据加载到OCT软件中。
   3. 右键点击B-scan图像；通过启用最多10个测量卡尺来配置卡尺，并输入其名称、角度和颜色。
   4. 通过在B-scan图像上右键点击并选择所需的卡尺，将其相应地放置在视网膜上进行测量。
      注意：对于以视神经乳头（ONH）为中心的扫描，在其两侧各设置5个卡尺，彼此等距分布。进行视乳头周围分析时，确保卡尺不要离ONH太远。对于径向扫描，分析OCT软件自动选择的每张扫描图像中的10幅图像，其编号可在“报告”（Reports）文件夹中找到。
   5. 通过右键点击B-scan图像并选择“保存结果”（Save results），将结果保存至电子表格软件中用于后续分析。
      注意：结果文件将保存在与扫描数据相同的文件夹中。
2. 或者，使用为开源图像处理程序开发的自制卡尺宏“MRI Retina Tool”（参见材料表）。
   1. 确保“MRI Retina Tool”和“Modify Polygon Section Tool”宏已激活。加载图像后，点击m按钮开始测量。
      注意： 该宏会自动在ONH两侧各创建一个0.2 mm长的测量单元。每个单元包含5个测量点，作为卡尺使用。其横向位置不可更改，专为径向扫描中的视乳头周围区域定制。测量单元的水平位置已预设为测量RNFL/GCL厚度，但可轻松修改以测量GC复合层。若扫描质量较差，需调整水平位置，或从分析中排除该图像。
   2. 进行水平调整时，点击e按钮。在新打开的“ROI Manager”窗口中选择第一个测量单元。
   3. 点击蓝色多边形按钮，通过点击图像中测量层的边界来调整第一个测量单元的位置。
   4. 在“ROI Manager”窗口中先选择第二个测量单元，再点击相应的图像，重复上述操作。点击r按钮重新测量。在“Measurements”窗口中查看结果。
      注意：结果可随时复制到电子表格软件中。结果包含以下数值：右测量单元（r）、左测量单元（l）及总计：Intden——测量单元内的积分密度；Area——测量面积（mm²）；Len——测量单元内卡尺长度（mm）；Mean——测量单元内信号的平均强度；Std——信号平均强度的标准误差。
   5. 继续处理下一张图像。
   6. 在电子表格软件中进一步分析数据。
      注意：要计算该层的平均厚度，取十个Len值的平均值。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠
Opa1delTTAG 小鼠	法国蒙彼利埃神经科学研究所，INSERM UMR 1051	-	携带 OPA1 c.2708_2711delTTAG 突变的 Opa1 基因敲入小鼠，背景为 C57Bl6/J
设备
EnVisu R2200 SD-OCT 成像系统	Bioptigen, Leica Microsystems, 德国	-	谱域光学相干断层扫描系统
EnVisu R2200 SD-OCT 成像系统软件	Bioptigen, Leica Microsystems, 德国	-	用于 OCT 图像采集与分析的软件
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, 美国国立卫生研究院	-	分析软件，需下载并安装两个自制宏：http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
自调节加热板	Bioseb, 法国	BIO-062	防止低体温
耗材
3"x3" 纱布垫	Curad, 美国	CUR20434ERB	防止低体温
双头棉签	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, 美国	-	凝胶涂抹
棉签棒	CentraVet, 法国	T.7979C.CS	小鼠定位
试剂与药物
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, 摩纳哥	-	散瞳
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, 法国	3397908	散瞳
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, 法国	3192342	局部麻醉
Imalgene 1000	Merial, 法国/CentraVet, 法国	IMA004	全身麻醉
Rompun	Bayer Healthcare, 德国/CentraVet, 法国	ROM001	全身麻醉、镇痛、肌肉松弛
NaCl 0,9%	Laboratoire Osalia, 法国	103697114	生理盐水
Systene Ultra	Alcon, Novartis, 美国	-	眼部保湿
GenTeal'	Alcon, Novartis, 美国	-	眼科凝胶，用于减少光线折射和混浊
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, 法国	59844	消毒剂