转导小鼠胚胎脑切片中皮层神经元径向迁移的延时成像

摘要

来源： Wiegreffe, C., 等 利用胚胎小鼠脑组织切片培养进行迁移神经元的延时共聚焦成像 子宫内 电穿孔 J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了通过转导小鼠胚胎脑切片中的放射状胶质支架，利用延时共聚焦显微镜观察皮层神经元从脑室下区向皮层板进行放射状迁移的过程。

方案

所有涉及动物样本的操作均已被相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 时间延时成像

1. 显微镜设置
   1. 将倒置共聚焦显微镜载物台上的气候室设定为37 °C和5%二氧化碳环境。使用混合探测器以降低激光强度，提高细胞存活率。为实现详细分析，建议使用工作距离超长的40倍干镜，数值孔径为0.6或更高。
      注意： 显微镜的所有组件需在成像前预热至37 °C，持续2–3小时，以确保成像过程中焦点稳定。
2. 脑片成像
   1. 使用倒置荧光显微镜，从含有膜插件的6孔板中选择用于成像的脑片。
      注意： 避免长时间暴露于紫外光下，以免造成细胞光损伤。
      注意： 选择上部室管膜下区（SVZ，Subventricular zone）中具有明亮单个神经元、且正向脑片软脑膜表面径向迁移的脑片。贯穿整个皮层板（CP，Cortical plate）的放射状胶质细胞细长荧光突起，表明放射状胶质支架结构完整，这是皮层神经元径向迁移所依赖的路径。
   2. 用镊子将选定用于延时成像的脑片及其膜插件转移至直径50 mm的玻璃底培养皿中，皿内含2 ml脑片培养基。将培养皿放入共聚焦显微镜的气候室中。
   3. 将分辨率设为512×512像素，并将扫描速度从400 Hz提高至700 Hz，使帧率分别从约1.4提高至约2.5帧/秒。平均扫描次数不超过两次。在电转染区域（通常为400–100 μm）定义z轴层扫，步长为1.5 μm。综合这些设置可在保持较低光毒性的同时，获得足够分辨率和亮度的图像。开始延时成像，每隔30分钟采集一次z轴层扫图像。
      注意： 脑片长时间暴露于激光下会引发光损伤，降低细胞活力。应相应调整激光曝光时间。
   4. 使用ImageJ软件（https://imagej.nih.gov/ij/）或等效软件分析延时成像序列。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔板	Corning	351146
倒置荧光组织培养显微镜	Leica	DM IL LED
共聚焦激光扫描显微镜	Leica	TCS SP5II
混合探测器	Leica	HyD
物镜，40倍/0.60 数值孔径	Leica	11506201
显微镜温度控制系统	Life Imaging Services	Cube, Brick & Box
细胞培养小室	Millipore	PICM0RG50
微型研磨器	Narishige	EG-45	打磨时使用38°角度
微量注射器	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III
带5 mm铂盘电极的镊子	Sonidel	CUY650P5
玻璃微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-97
盒状灯丝	Sutter Instrument	FB255B	2.5 mm × 2.5 mm
微型药匙刮刀	VWR	231-0191	185 mm × 5 mm
50 mm玻璃底培养皿	World Precision Instruments	FD5040-100