使用共聚焦显微镜对斑马鱼幼鱼进行单神经元选择性激光消融

摘要

来源： Morsch, M., et. al., 利用常规紫外激光共聚焦显微镜诱导细胞应激与死亡。 J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们探讨利用高强度紫外激光消融技术，精确靶向并研究转基因斑马鱼中的单个神经元。我们将演示如何制备、固定以及观察神经元的反应，重点展示损伤与恢复过程中的细胞动态变化。

方案

1. 准备用于斑马鱼在琼脂糖中包埋的溶液。
   1. 通过将4 g/L MS222（三卡因储备液，pH 7.0）逐滴加入含有卵水的培养皿中，制备麻醉溶液。建议起始剂量为50 mg/L（图1A）。
   2. 在卵水中配制低熔点琼脂糖（0.8 - 1.5%）储备液，并分装至1.5 mL微量离心管中。取一份样品放入预热的金属浴（38 - 40 °C），使其平衡至设定温度（约30分钟；图1B）。
   3. 可选：对于长时间成像（> 4 h），在35 mm玻璃底培养皿内制备一个小的琼脂糖环，并使其凝固。
      注意：此额外步骤可有效避免在较长时间内整个含斑马鱼的琼脂糖液滴发生移动。
      1. 具体操作为：将约300 µL琼脂糖沿玻璃底培养皿内圈涂抹，形成一个中间留有小开口的环形（“甜甜圈”状），以便放置鱼体（步骤1.5.3）。
2. 将斑马鱼包埋于琼脂糖中以进行显微观察。
   1. 选取1 - 3条预先筛选好的斑马鱼用于消融实验，使用移液器将幼鱼转移至含有麻醉液的培养皿中进行麻醉（步骤1.4.1；图1C；约5分钟）。
      注意：当鱼体表现出鳃盖运动微弱、心率降低且不再出现触碰诱发的逃避反应（TEER；即轻触尾部后不再游动）时，表明已进入麻醉状态。确保麻醉充分，以符合动物伦理要求，并防止在转移至琼脂糖或暴露于荧光光下时发生抽搐。
   2. 确认麻醉完成后，使用可调式移液器（配以剪去尖端的200 µL吸头，设定体积约为30 µL）吸取一条幼鱼，使其沉降至吸头底部。将幼鱼连同液体一并释放至预热的琼脂糖中（尽量减少卵水进入琼脂糖；图1D）。
   3. 吸取被琼脂糖包裹的鱼体，迅速将其滴加至先前准备好的35 mm玻璃底培养皿中。
   4. 使用解剖显微镜和标准画笔（长平头，1号）将动物在琼脂糖中侧向摆放（头部朝左），使身体和尾部保持平展（图1E）。若同时处理多条鱼，应将所有鱼体在培养皿中整齐排列，以便后续使用共聚焦显微镜时易于定位。
      注意：此摆放与排列操作需迅速完成（可能需要一定练习，因为琼脂糖在接触较低温度后会立即开始凝固）。
   5. 让包埋在琼脂糖中的鱼静置10 - 15分钟，直至琼脂糖完全凝固。小心地向35 mm培养皿中补充约2 mL含三卡因的卵水（图1F）。

2. 设置共聚焦显微镜及成像参数

1. 将含有幼虫的培养皿置于共聚焦显微镜载物台上，聚焦于动物脊髓的背侧（使用明场模式）。在适当的放大倍数（40X）和荧光设置下观察样本，以确认目标结构的成像状态（例如标记神经元的荧光强度或小胶质细胞的运动），确保所有成像参数均满足后续消融实验的要求（图2）。我们常规使用40X物镜进行时间序列成像研究。
2. 可选步骤：若需进行持续数小时的时间序列研究，建议在消融前记录单个或少数几个时间点的数据，以建立细胞及其微环境未受干扰的生理反应基线（例如小胶质细胞的运动，用于确定基础速度和迁移活性）。
3. 确定目标结构用于紫外激光消融的厚度。
   1. 使用Z轴驱动功能，通过手动上下调节焦距，确认目标结构（例如细胞胞体）的顶部和底部位置。记录将要进行消融的Z平面（例如细胞中心）。
      注意：根据经验，本方法在靶向标记明亮的脊髓神经元（具有高信噪比，便于消融后进行时间序列成像观察；例如 图4）以及消融细胞胞体中部时效果最佳。利用细胞核的荧光信号有助于确保准确定位并提高消融效率。

3. 对斑马鱼脊髓中的单个细胞进行靶向激光消融

注意： 本研究中采用共聚焦显微镜（Leica SP5）进行消融与成像。使用405 nm激光二极管进行细胞特异性消融的操作步骤，依据软件（Leica Application Suite，v2.7.3.9723）进行详细设定。然而，任何配备405 nm激光器以及FRAP（光漂白后荧光恢复）或漂白模块的传统共聚焦显微镜均可实现类似的细胞操作，但具体设置、参数和名称可能略有不同。

1. 通过点击软件菜单顶部的下拉菜单（图 3A，1 和 2）启动 FRAP 向导。观察出现的新窗口，该窗口包含多个步骤，可用于设置激光消融的特定参数（图 3B，3）。
2. 通过选择图像格式、扫描速度（图 3B，4）和平均次数（图 3B，5）来确定消融方法的图像参数。1,024 × 1,024 的图像格式、400 Hz 的扫描速度以及 4 次线平均最为适用。
   注意：通常无需更改光谱检测参数（如激发或发射参数），因为这些参数已在先前的图像采集过程中确定。
   1. 如果尚未选择用于消融的 z 平面（如步骤 2.4 中所述），请按下“实时”按钮，并通过样本调焦，直至荧光结构或目标 z 平面清晰对焦。
3. 在设置完基本图像参数后，进入“漂白”步骤（图 3C，6）以控制具体的消融组件。
   注意：激光强度（图 3C，8）、扫描速度以及在步骤 3.2 中设定的平均次数（图 3B，4 和 5），以及在步骤 3.5 中设定的重复次数（图 3E，12），将共同决定紫外激光在 ROI 区域的总停留时间，从而影响漂白效率。
   1. 通过激活 405 nm 激光以用于漂白程序（图 3C，8）。
      注意：在我们的实验设置中，使用 60–80% 的 405 nm 激光强度可获得最佳效果。需注意，该激光输出功率因仪器而异，不同共聚焦系统之间会有所不同。
   2. 使用“放大”选项（图 3C，7）通过缩小扫描范围来最大化选定 ROI 区域的漂白强度，从而延长停留时间。或者，也可使用所选软件中的“漂白点”选项完成此过程。
4. 在图像采集窗口中使用任意绘图工具（图 3D，9）选择一个或多个 ROI 区域（图 3D，10）进行消融。例如，使用直径约 4–8 µm 的圆形绘图工具靶向轴突起始段。
   注意：消融区域可根据应用需求从单个像素调整至更大范围。
5. 确定 ROI 后，选择“时间序列”按钮（图 3E，11），并确认 ROI 区域将被扫描/消融的循环次数（图 3E，12）。根据需要选择“漂白前”和“漂白后”帧，以便在漂白过程前后快速查看整个图像。
6. 在设定所有必要的消融参数后，点击“运行实验”（图 3E，13）并监测消融效率。
   注意：在我们的 FRAP 设置中，FRAP 循环前后将使用适当的激光激发（例如，EGFP 表达细胞使用 488 nm 激发）各采集一张图像。这些漂白前后的图像可快速判断 ROI 区域的漂白效果以及所选消融参数的有效性。
7. 若在完成 FRAP 循环后，所选 ROI 区域仍显示较高的荧光强度，则需通过调整激光强度（图 3C，8）、扫描速度和平均次数（图 3B，4 和 5），以及重复次数（图 3E，12）来重复该过程。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低熔点琼脂糖	Fisher-Scientific		用含三卡因（0.02%）的卵水溶解，浓度为0.8-1.5%
三卡因	Argent Labs	MS-222	0.02%
带纤维丝的标准壁硼硅酸盐毛细玻璃管	World Precision Instruments, Inc.	GC100F-10（短） GC100F-15（长）	拉制至电阻为2-7 MΩ
卵水			10升去离子水中加入0.6克Instant Ocean海盐和4毫升1毫克/毫升的亚甲蓝
加热块	Select BioProducts	数字加热块（SBD110_）
显微镜	Leica	SP5
35毫米玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-0-20-C