TSPO-PET/CT成像用于检测缺血性脑卒中 小鼠模型中的梗死形成

摘要

来源： Chaney, A. M., et.al. 利用[¹¹C]DPA-713对缺血性卒中模型小鼠进行神经炎症的PET成像。 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种利用TSPO特异性放射性示踪剂对缺血性脑卒中鼠模型中的神经炎症进行活体成像的技术。注射示踪剂后，其会结合位于线粒体外膜且在活化的免疫细胞中过表达的TSPO蛋白。PET/CT扫描仪检测示踪剂的分布情况，并生成与CT数据共同配准的图像，从而实现脑内神经炎症区域的精确定位。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. PET/CT 校准与工作流程设置（dMCAO 手术后第 6 天）

1. 在扫描仪操作软件中创建成像工作流程，包括CT衰减采集、60分钟C-11动态PET采集（350 - 650 keV能级判别，3.438 ns符合时间窗）、直方图（20帧：5 × 15秒，4 × 1分钟，11 × 5分钟；并进行死时间校正）以及3DOSEM-OP重建（2次迭代，18个子集），以生成体素尺寸为0.776 × 0.776 × 0.96 mm的128 × 128 × 159图像。
2. 通过界面左上角的CT校准面板执行X射线源预热。该校准必须每周进行一次，或在系统过去48小时内未使用时于扫描前执行。
3. 执行暗场/亮场（D/L）和中心偏移（C/O）校准。
   1. 点击界面左上角的CT校准按钮（X）。
   2. 为即将运行的CT文件选择D/L和C/O，将床板从机架中移出，然后运行D/L校准。
   3. 将校准工具床板插入扫描仪，并运行C/O校准，确保在界面上将选择从“70 mm palette”切换为“calibration tool”。
4. 移除校准工具，并将标准PET床板放回，同时确保在界面上将选择重新改回“70 mm palette”。
5. 使用胶带将四只小鼠用成像床固定在扫描平台，并连接麻醉管路（图1A）。确保异氟烷正在管路中流动，且无任何弯折。
6. 将床板向前推进，使其位于视野（FOV）中心，关闭CT门，获取CT定位像，以确认床板位置正确。
7. 使用实验室自制的含有已知剂量C-11溶液的模体作为辐射源，对PET/CT扫描仪执行“标准”校准。
   1. 准备一支20 mL注射器，其中装有相当于单只小鼠给药剂量的示踪剂（约250 - 350 µCi/9 - 13 MBq的C-11示踪剂溶于生理盐水中）。
   2. 使用活度计记录标准源中的放射性活度，并记录测量时间。
   3. 使用与小鼠成像完全相同的参数（如上所述）对标准源进行PET/CT扫描。每周执行一次，以生成用于校正PET扫描仪成像数据的校正因子。

2. PET/CT 成像的工作区设置

1. 使用具有病毒灭活作用的消毒剂（参见材料表）并铺设防护性吸水垫于所有操作表面，以建立无菌环境。
2. 确保异氟烷和氧气罐内气体充足。
3. 准备尾静脉导管：用0.9%氯化钠溶液（无菌生理盐水）填充一支1 mL注射器（配备27.5 G针头），并通过一个27.5 G、24 cm的蝶形导管进行冲洗。在插管前剪除导管的翼片，以避免遮挡尾静脉视野，并便于将小鼠移入扫描仪时操作，防止导管移位。
4. 确保工作台上已备齐所有必要设备，包括备用“冲洗”注射器（装有无菌生理盐水）、眼用润滑剂、乙醇棉片、加热灯、预充盐水的导管、手术胶带、组织粘合剂、0.5 mL剂量注射器、剪刀以及用于在导管成功置入尾静脉后封口的打火机（图1B）。

3. 动物准备与插管

1. 称重小鼠以确定每只小鼠允许注射的最大体积（即示踪剂和任何给予的生理盐水总体积不得超过体重的10%）。
2. 使用3%异氟烷在诱导室中对小鼠进行麻醉，并以1-2%浓度维持（2 L/min 100% O₂）。
3. 为每只小鼠涂抹眼用润滑剂，并通过足底反射（脚趾夹捏）确认麻醉状态。如有必要，调整麻醉深度。
4. 将小鼠置于带有鼻罩的加热板上，以1-2%浓度输送异氟烷（2 L/min 100% O₂）。
5. 在小鼠麻醉状态下，按照以下方案进行尾静脉插管：
   1. 将小鼠侧放，暴露一侧侧静脉，同时保持头部位于鼻罩内。
   2. 使用加热灯对尾部进行加温，注意避免过热或烫伤，并用酒精棉片擦拭以扩张静脉并消毒注射部位。
   3. 持针时针尖斜面朝上，与静脉呈锐角对齐。
   4. 轻轻施加压力刺穿皮肤，并放平针头使其与静脉平行。
   5. 缓慢向前推进数毫米，使针头完全进入静脉。
   6. 通过注入少量（10–20 µL）生理盐水冲洗，确认导管位置正确。生理盐水应顺畅地从注射器排出，静脉应变得清晰。若观察到任何阻力或回压，表明导管可能未在静脉内，建议重新尝试插管。若观察到凝血现象，应在插管设置和冲洗时使用肝素（每毫升生理盐水中含1,000单位肝素）。
      注意：我们已在目标小鼠品系中评估了使用和不使用肝素的插管效果，由于未观察到凝血现象，因此仅使用生理盐水进行插管。
   7. 使用少量组织胶将导管固定在尾部，再用外科胶带加固，确保在将小鼠转移至扫描仪时导管保持稳定不动。
   8. 从导管末端取下冲洗用注射器，并用打火机火焰封口，确保操作人员远离异氟烷或乙醇环境。
   9. 对另外3只小鼠重复上述操作，使所有4只待扫描小鼠均完成插管并准备就绪。
6. 开启连接至PET/CT的麻醉气体流（2.5%异氟烷，2 L/分钟 100% O₂），小心地将小鼠俯卧位放置于扫描床中，确保导管位置固定，每只小鼠的头部在鼻罩内保持平直且稳固。使用柔软的外科胶带将每只小鼠的头部和身体固定在扫描床上，注意胶带位置不得限制呼吸。记录每只小鼠的位置，以便后续图像分析时准确定位和分组。
7. 在整个操作过程中保持小鼠体温（例如使用加热灯或热空气泵系统，确保小鼠保暖但不过热）。通过目视观察（若使用开放式机架）或远程监测系统（使用呼吸垫）监测所有小鼠的呼吸频率，并根据需要调整麻醉深度。

4. CT 图像采集

1. 待动物固定于床面且呼吸稳定后，开启激光十字线，并移动扫描床，使十字线与四只小鼠的脑部对齐。将扫描床移至采集位置（位置3），尽可能使小鼠脑部位于视野（FOV）中心。
2. 采集小鼠的定位像以确认其位置（使用200 mm FOV），如有需要，可通过拖动界面上的FOV框调整位置。在扫描仪软件中点击“Start Workflow”以开始CT扫描，并确保选中“display interactive user prompts”，以便在示踪剂注射前手动启动PET扫描。

5. [¹¹C]DPA-713 剂量配制

1. 合成 [¹¹C]DPA-713，操作时需穿戴适当的个人防护装备（PPE），以安全处理放射性物质，包括实验服、手套以及个人手指和身体剂量计。为防止放射性污染，应定期更换手套，并在可能的情况下尽量增加与放射源的距离。
2. 使用镊子小心地将放射性示踪剂小瓶转移至铅屏蔽后方。
3. 为每只小鼠准备0.5 mL剂量注射器，内含约250–350 µCi/9–13 MBq的放射性物质，体积为100–200 µL，以确保剂量足以支持60分钟的动态PET扫描（给药剂量应根据同位素的半衰期和实验设计的时间线确定，注射体积则需根据小鼠体重调整）。
4. 使用设置为C-11的剂量校准仪（应位于插管操作点附近）测量放射性活度，并记录测量和注射时间，以便进行衰变校正。在CT扫描即将结束前立即抽取药液，以减少衰变，确保每只小鼠注射时达到预期的放射性活度水平。
5. 在测量活度和向每只小鼠注射前，需确认剂量注射器中无气泡。

6. PET 采集

1. 当小鼠自动从CT进入PET扫描后，准备在扫描仪后方进行[¹¹C]DPA-713注射（图1C）。在平台边缘放置防护性吸水垫，并确保剪刀和打火机已备好。
2. 用剪刀剪开封闭的导管管路，检查导管内无气泡，通过注入10–20 µL生理盐水冲洗以确认套管仍位于静脉内。将步骤5.4中已量取剂量的注射器分别装入4根导管中，并记录每只小鼠所接受的剂量。
3. 当PET扫描准备就绪时点击“确定”，同时启动10秒计时器。安排两名研究人员在扫描仪后方手持剂量注射器，待计时器归零时同时为4只小鼠注射。用50–100 µL生理盐水冲洗每根导管（根据导管长度而定——即死体积），以确保全部剂量进入尾静脉，然后再次使用打火机将管路重新密封。
4. 使用剂量校准仪测量注射器中的残留放射性活度（注射器中剩余的示踪剂），记录测量数值及测量时间。
5. 扫描完成后，使用运动控制面板中的水平“归位”按钮将PET床返回初始位置。将小鼠从扫描仪中取出，小心移除导管，并轻压插管部位以防止过度出血。
6. 使用剂量校准仪测量导管中的残留放射性活度。
7. 若需让小鼠恢复，应确保其处于温暖环境中（例如置于带有加热垫的盒子中，或盒内放置装有温水的手套），以促进恢复。若计划对小鼠实施安乐死，则将其放入含有异氟烷的诱导室中，使其在灌注安乐死前保持麻醉状态。
8. 为重建数据，请打开后处理管理软件（参见材料表），该软件将自动使用由lst文件生成的直方图数据重建每次扫描。

7. 动态 PET 图像分析

1. 打开图像分析软件（参见材料表），点击“打开数据”图标以加载CT图像（作为源图像），并点击“追加数据”图标以加载动态PET图像（作为参考图像）。

2. 通过下拉菜单中的时间序列操作符对数据进行视觉质量控制：选择参考（“ref”）和“global”，并为颜色标尺设置合适的最小值和最大值。逐帧可视化动态 PET 数据，验证放射性信号的摄取情况，并检查扫描过程中是否存在任何运动干扰。

3. 使用“算术运算符”创建平均 PET 图像。

1. 选择“平均选定帧”，取消选择“ref”，并确保已选中输入1（“Inp1”）、输入2（“Inp2”）和输入星号（“Inp*”，包含扫描中其余所有PET帧），以生成所有PET帧的平均图像。

2. 进入“数据管理器”选项卡（DM），将平均图像拖动至“输入1”位置以进行可视化。通过点击“最小-最大”工具中的自动计算，重新调整颜色标度。

4. 在“重新定向/配准”下拉菜单中使用“自动3D”功能，将CT图像配准到平均PET文件。

1. 选择“ref”和“Inp1”，并选择“rigid”、“fast”、“Inp1 to Ref”配准模式。在所有三个维度中目视检查配准效果，并在必要时通过“manual 3D”选项卡中的“translation”和“rotation”功能进行手动调整。

2. 当对配准结果满意后，选择“Inp2”和“Inp*”，然后单击对勾按钮将其应用到所有PET帧。在DM中右键单击CT和PET文件，并另存为原始格式（raw）。

5. 每次取一只小鼠的脑组织进行脑部分析，以CT图像作为引导：从下拉菜单中选择“裁剪”功能，拖动图像边界，将小鼠头部在脑干以下部分裁剪掉。使用上文所述的“手动3D重定向”功能，对PET和CT图像进行重新定向，使颅骨在所有维度上均保持正直。

6. 使用界面左上角的“追加数据”按钮，加载该小鼠的MR图像（DICOM格式）。通过“手动3D重定向”功能移动MR图像，并将其与CT图像中的颅骨对齐（确保所有模态图像方向一致）。

7. 使用“3D ROI 工具”在 MR 图像上绘制卒中感兴趣区域（ROI）。

1. 在可视化控制器选项卡（VC）中取消选中 PET 可视化，关闭其显示，仅使用 MR 和 CT 图像绘制感兴趣区域（ROI）。

2. 单击“添加感兴趣区域（ROI）”按钮以创建新的 ROI，并将其命名为“infarct”。选择“样条工具”，通过左键单击绘制 ROI 边界，再通过右键单击闭合该区域。

3. 对包含卒中区域的所有切片重复此操作，确保在感兴趣区域（ROI）中不包含任何颅骨部分，最佳做法是在颅骨边界与卒中ROI之间保留一个体素的间隙。

8. 使用梗死体积生成对侧 ROI。

1. 创建一个新的感兴趣区域（ROI），并将其标记为“contralateral”。右键单击梗死 ROI，选择“export”。将该 ROI 拖动至位置 2（“Inp1”）。

2. 仅选择“Inp1”后，使用“重定向/配准”菜单中的“operator”功能进行左右翻转。勾选“ROI”框，选择“仅查看”模式，并手动将新的ROI移动到对侧相同的位置。选择“arithmetic's”算子，对新ROI应用2倍的标量乘法，以实现对ROI的独立定量分析。

3. 返回到 3D ROI 工具。进入“专家与实验”选项卡，点击“导入 ROI”按钮。在对话框中选择 Inp1，将新体积加载为对侧 ROI。

9. 右键单击平均 PET 图像将其卸载，然后重新打开 PET。使用 3D ROI 工具中的“导出结果”图标生成定量摄取结果。

10. 如有需要，可进行额外的半脑分析（例如，使用 Vivoquant 软件的 3D 小鼠脑图谱插件模块，自动生成功能感兴趣区，以分别分析右侧与左侧脑半球区域）。

1. 重新加载已配准的PET/CT图像。

2. 点击“高级模块”菜单并选择 3D 脑图谱工具，以导入小鼠脑图谱。在“高级设置”中选择“左侧/右侧所有区域”，然后点击“运行”以导入 3D 图谱。

3. 使用颅骨作为边界，手动将图谱与大脑结构对齐。

4. 重新运行图谱生成程序，确保勾选“导入3D ROI”选项，以生成包含全部14个左侧和右侧半脑ROI（延髓、小脑、中脑、脑桥、大脑皮层、海马、丘脑、下丘脑、纹状体、苍白球、嗅球、胼胝体和白质）的结果电子表格。

11. 使用扫描仪操作软件定量分析脾脏中的示踪剂摄取（参见 材料表）。

1. 在数据库中选中 PET 和 CT 图像文件，然后点击“general analysis”以加载图像。

2. 点击注册选项卡，然后点击“刚性配准”图标，对PET和CT图像进行共同配准。

3. 单击 ROI 定量分析标签，点击“创建 ROI”图标，并将其命名为 spleen。

4. 选择“球体”工具，参考 CT 文件绘制脾脏感兴趣区域（ROI），确保不与肾脏摄取区域重叠（利用 PET 图像和信号避免来自肾脏的溢出效应）。

5. 编辑感兴趣区域（ROI），以保持动物间 ROI 体积的一致性。

12. 计算摄取归一化的标准校正值。

1. 从标准扫描中加载 PET/CT 数据，并使用“手动 3D ROI”工具创建一个包含 20 mL 注射器的圆柱形 ROI。

2. 使用电子表格图标获取标准品中所含放射性活度的水平。

3. 使用该 nCi/cc 结果和标准品原始记录的放射性活度（即剂量校准器测得的标准品放射性活度，单位为 nCi/cc），为 PET 摄取值建立校正因子。具体方法是，将剂量校准器记录的标准品放射性活度除以从标准品的 PET 图像计算得到的放射性活度。

13. 利用剂量活度和测量时间对所有小鼠进行衰变校正，以获得PET扫描时的剂量活度（即计算PET扫描开始时的剂量活度）。

14. 对残余值重复上述步骤，并从衰变校正后的剂量中减去，以计算每只动物实际接受的放射性活度。

15. 应用此衰减校正后，还需应用标准校正，以确保数据处于正确的活性水平。确保将这些校正应用于手动绘制的感兴趣区域（ROI）结果，以及与dMCAO位置相关的脑图谱ROI数据（即皮层、海马和纹状体）。

16. 使用以下公式计算所有感兴趣区域（ROI）的 %ID/g：%ID/g =（ROI 放射性活度，单位为 nCi/cc / 衰变校正后的给药剂量，单位为 nCi/cc）×100。利用绘图软件将 %ID/g 对时间作图，为每个 ROI 生成时间-放射活性曲线。

17. 使用扫描仪软件进行最终图像可视化和图例生成。根据每只小鼠在扫描时所接受的衰变校正剂量对图像进行归一化处理，确保所有图像均处于相同的 %ID/g 标度下。

注意：这是为了能够准确比较来自不同小鼠的图像和/或在不同日期进行的研究所获得的图像。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Inveon PET/CT 扫描仪	西门子	版本 4.2
VivoQuant 软件	InVicro	版本 2.5	图像分析软件
Inveon 研究工作站软件	西门子	版本 4.2	扫描仪操作软件。包含 microQView，即后处理管理软件
剂量校准仪	Capintech		CRC-15 PET
Typhoon 磷光成像仪 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
蝶形导管	SAI Infusion Technologies	BFL-24	27.5 G 针头
1 mL 注射器	BD
胰岛素注射器	BD	329461	0.5 mL 带针头胰岛素注射器
20 mL 注射器	VWR	BD302831	BD 带滑动接头刻度注射器
组织胶	Santa Cruz Animal Health	sc-361931	3 mL
加热灯	Fluker	27002	5.5 英寸爬行动物加热灯，带夹具和开关
0.9% 无菌生理盐水	辉瑞	00409-4888-10	0.9% 氯化钠注射液，10 mL
Chux 吸水垫	赛默飞世尔科技	1420662	一次性吸水垫
虹膜剪	World Precision Instruments	503708-12	11.5 cm，直型，12 件装
手术胶带	3M Durapore	1538-0	1/2 英寸 × 10 码卷，丝质，低致敏性
小鼠 PET 床	本实验室自制		4 只小鼠 PET 床
打火机	Bic	UDP2WMDC
异氟烷	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Isothesia，吸入麻醉剂， 250 mL
氧气	Praxair	UN1072	压缩气体
眼润滑剂	Watson Rugby	PV926977	人工泪液润滑眼膏， 1/8 盎司