来源： Huang, Y. et. al., 利用光学相干断层扫描对三维肿瘤类器官进行纵向形态学与生理学监测。J. Vis. Exp. (2019)
本视频展示了如何利用光学相干断层扫描技术（OCT）通过获取高分辨率的横截面图像，在多孔板中对肿瘤类球体进行监测。通过分析来自细胞结构的光反射信号，OCT可构建三维模型，用于评估大小和形状等形态学特征，并根据随时间变化的光散射差异区分活细胞与非活细胞。
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方法文章
利用光学相干断层扫描技术对肿瘤类球体进行形态学与生理学监测
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2025年5月29日
本文内容
摘要
方案
1. 细胞准备
- 从合格供应商处获取细胞系。
注意：需确认目标细胞系可在培养基中或借助基质（如Matrigel等基底膜基质）形成类球体。可查阅相关文献或进行一轮预实验以验证。 - 按照细胞系供应商提供的具体操作流程解冻冻存细胞。通用流程可参考其他资料。
- 将细胞在25 cm2培养瓶中传代培养1-2代，即可用于三维细胞培养。
- 每日监测细胞健康状态，并在标准条件下（37 °C，5% CO2，95%湿度）的培养箱中维持培养。根据需要更换培养基。
注意：培养基组成为：含4.5 g/L葡萄糖的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、1%抗生素-抗真菌剂和10%胎牛血清（FBS）。在细胞达到培养瓶中汇合前进行传代。遵循供应商提供的细胞培养指南。通用流程可参考其他资料。 - 根据以下通用方案在多孔板中进行三维细胞培养。
- 从培养瓶中移除培养基，并用37 °C预热的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。
- 向培养瓶中加入1 mL 0.5%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），作用3分钟以重悬细胞，随后加入培养基以中和胰蛋白酶。
- 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温下以500 x g离心5分钟。
- 移除上清液，用4 mL预热的培养基重悬细胞。取一滴样品滴加至血细胞计数板进行细胞计数，以确定细胞浓度。将细胞稀释至适宜的接种浓度（例如，3,000个细胞/mL）。
注意：针对每种细胞系和每种类型的多孔板（96孔、384孔或1536孔板），需优化类球体的初始细胞浓度。 - 将细胞接种至超低吸附（ULA）圆底多孔板中。每孔加入200 µL细胞悬液，细胞浓度为3,000个细胞/mL，使每孔约含600个细胞。
- 接种后立即在室温（RT）下使用板适配器对整块多孔板进行离心，速度为350 x g或可设置的最低转速，离心7分钟。
注意：离心有助于将细胞聚集至孔底中心，从而促进形成单一且均一的类球体。该离心步骤仅在开始时进行一次，用于形成肿瘤类球体，后续类球体生长过程中不再重复。 - 将多孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中维持培养，并每3天更换一次培养基。
注意：不同三维培养条件下的生长时间可能不同。在本研究中，U-87 MG和HCT 116细胞系均使用96孔板，接种浓度为3,000个细胞/mL，HCT 116细胞在4–7天内可生长至约500 μm。根据通用三维培养方案，可针对不同类球体模型添加培养基补充物和生长因子。 - 为进行类球体生长的纵向研究，每隔3–4天进行一次光学相干断层扫描（OCT）成像。
注意：建议的OCT成像时间点为第4天、第7天、第11天、第14天、第18天和第21天。
2. 高通量 OCT 成像平台
注意：有关本研究中使用的定制光学相干断层扫描（OCT）成像系统的详细信息，请参见图1。
- 为用于肿瘤球体成像的光学相干断层扫描系统选择合适的宽带光源。
注意： 此处使用一个超发光二极管（SLD， 图1A, B中心波长约为1,320 nm、带宽为110 nm的宽带光源被用作光源。 - 按照示意图构建OCT系统的参考臂和样品臂（参见 图1A, B 有关详细信息）。该 Table 的 材料 列出构建光学相干断层扫描（OCT）系统所需的光学组件。确保参考臂和样品臂的光路长度尽可能匹配。
- 构建光谱仪，包括准直器、光栅、F-theta 镜头和线阵扫描相机（参见 图1C 有关OCT光谱仪设计的设置细节，请参见光谱仪设计部分。或者，选择与光源中心波长匹配的商用光谱仪。确保光谱仪正确对准，以覆盖整个激光带宽，实现高光子收集效率，并提供缓慢衰减的干涉图样。
- 表征OCT系统的性能，包括样品臂功率、总成像深度、深度依赖性灵敏度、轴向分辨率、焦深和横向分辨率等指标。放置一个弱反射体（例如，将带有中性密度滤光片的镜子作为样品，用于测量深度依赖性灵敏度、轴向分辨率和焦深。将美国空军（USAF）分辨率测试图靶作为样品，以检测横向分辨率。
- 选择一个电动平移台，以提供多孔板的水平移动，从而对不同孔中的肿瘤球体进行成像（参见 图1B使用行程范围大于108 mm × 72 mm的载物台，以确保对多孔板中所有孔进行完整扫描。采用由软件控制的二维（2D）或三维（3D）电动平移载物台，以实现每个孔的精确定位，并实现OCT系统的自动化，从而支持高通量成像。
- 使用平板适配器或设计一个平板支架（通过3D打印）以固定多孔板的位置。
- 在进行任何OCT成像之前，使用安装在平移台上的二维倾斜调节台和旋转台，校正多孔板的倾斜和旋转（参见 图 一维) 以尽量减少不同孔之间焦平面的差异。在监测OCT图像中各孔的相对位置时，使用D2、D11、B6、D6和G6作为引导孔。图1A).
- 调整培养板的旋转角度，确保其边缘与载物台移动方向平行，从而使各孔在光学相干断层扫描图像中保持相同的水平位置（图1E）。调节培养板的倾斜度，使其与光学平台平行，以确保在OCT成像过程中各孔保持相同的垂直位置（图1F).
注意： 调整倾斜角度和焦距有助于优化所有孔的OCT图像质量。然而，不同孔中培养基高度的差异可能导致光路变化，从而引起类球体图像失焦。可采用自动对焦技术控制OCT成像的焦平面，以获得最佳图像质量。然而，以下因素导致的肿瘤类球体OCT图像质量不佳，无法通过调整步骤解决：初始接种位置导致的类球体偏心；嵌入生物制造的细胞外基质时类球体抬高；培养板质量差，孔底高度差异较大。可引入具备自动对焦或自对准功能的附加软件控制，以优化OCT成像系统的性能。 - 为依次采集每个孔的数据，定制的计算机程序控制光学相干断层扫描成像及载物台移动。
3. 肿瘤类器官的光学相干断层扫描及图像处理
- 在进行肿瘤类球体的OCT成像当天，将多孔板从培养箱中取出，转移至OCT成像系统下方，并将其放置在板适配器上。
注意：肿瘤类球体的OCT成像可在聚苯乙烯板盖开启或关闭状态下进行。然而，由于孔内液体蒸发而在盖子上形成的水凝结可能影响光的透射并扭曲光路，从而导致从类球体获得的OCT图像质量下降。 - 通过移动平移台的z方向来调节板的高度。将焦平面位置保持在每个类球体顶部表面以下约100–200 μm处，以最小化非均匀深度方向焦斑轮廓的影响。
- 在自定义软件中，根据肿瘤类球体的发育阶段设置适当的OCT扫描范围（例如，1 mm × 1 mm），以覆盖整个肿瘤类球体。点击 保存参数 以保存设置。
- 使用自定义软件逐一获取含类球体的多孔板中所有孔的三维OCT图像。点击 预览 按钮查看预览图像，然后点击 采集 按钮以采集OCT图像。
注意：确保在平移台静止时采集OCT类球体数据。类球体通常位于U型底孔的中心位置。然而，当平移台加速或减速时，由于类球体在培养基中的惯性作用，其位置可能在培养液中发生偏移。 - 使用自定义C++处理代码对肿瘤类球体的三维OCT数据集进行处理，以生成OCT结构图像。OCT数据后处理流程图见 图2A。
注意：生成的三维OCT结构图像见 图3A。- 校准三个维度上的像素尺寸，并在修正后的尺度上重新缩放OCT结构图像。
注意：OCT图像轴向（z方向）的距离测量的是参考臂与样品臂之间的光程差。因此，在对轴向像素尺寸进行校准和重新缩放时，需考虑样品的折射率（n）。在本研究中，我们采用n = 1.37作为肿瘤类球体的折射率。
- 校准三个维度上的像素尺寸，并在修正后的尺度上重新缩放OCT结构图像。
- 利用穿过类球体质心的三个正交截面（XY、XZ和YZ平面）的二维OCT图像生成类球体图像拼合图。类球体图像拼合图的代表性输出见 图4C–E。使用MATLAB函数dftregistration对所有类球体进行图像配准，以确保所有类球体的质心大致位于相同位置。
- 使用商业或自定义软件生成类球体的三维渲染图像。
注意：以下步骤说明如何使用商业软件获取肿瘤类球体的三维渲染图像。- 将三维OCT数据加载到软件中。
- 点击 Surpass 面板，然后点击 添加新体积。选择用于三维渲染的 融合 模式。
- 通过鼠标指针拖动图像来调整观察角度。
4. 三维肿瘤球体的形态学定量分析
注意：使用 MATLAB 编写的自定义代码处理该定量分析。点击 运行 按钮以启动该过程。有关类球体形态定量步骤的流程图，请参见 图 2B。
- 定量分析类球体的直径、高度及基于直径的体积。
- 选择穿过类球体中心点的三个正交截面（XY、XZ 和 YZ 平面）的二维 OCT 图像。
- 分别在 XY 和 XZ 平面中测量类球体的直径和高度。
- 使用以下公式计算基于直径的类球体体积：
，假设肿瘤呈球形。
- 基于体素定量分析类球体体积。
- 对类球体的OCT结构数据应用三维均值滤波器，以去除散斑噪声。
- 逐帧使用Canny边缘检测滤波器对肿瘤类球体进行分割，并设置适当阈值，以区分类球体区域与孔底。
- 对三维数据中的连通体素进行分组（参见内置函数：bwconncomp）。
- 计算每组中各连通体素到类球体质心（手动选定）的平均距离。将平均距离最小的组确定为类球体区域。
- 统计类球体区域内体素的数量，再乘以单个体素的实际体积（volume/voxel），得到类球体的总体积。
5. 三维肿瘤球体的死细胞区域检测
注意：在均匀介质中，光学相干断层扫描（OCT）检测到的背向散射强度随深度（I(z)）的变化可用比尔-朗伯定律描述：
其中 z 表示深度，μ 为光学衰减系数，I0 为入射到样品的光强。因此，推导出的光学衰减系数可表示为：
由于OCT图像通常以对数尺度绘制，可通过提取OCT强度分布曲线的斜率来推导光学衰减系数。生成光学衰减图的流程参见图2C。
- 进行分割以去除类球体外部的无关区域。使用三维均值滤波器抑制光学相干断层扫描（OCT）图像中固有的散斑噪声。
- 通过对特定深度范围内（滑动窗口）的对数尺度OCT强度剖面进行线性拟合，提取其斜率，并将斜率乘以-1/2，从而获得逐像素的光学衰减系数。
注意：每个位于分割后类球体区域内的体素的衰减系数，是基于一个10个体素深度窗口（约40 μm深度）内OCT强度剖面斜率计算得出的，该体素位于窗口的中心位置。 - 将上述方法（步骤5.1和5.2）应用于包含分割后类球体区域的每一帧中的每个轴向扫描，以及三维数据集中的每一帧，直至计算出分割后类球体区域内所有体素的光学衰减系数。
- 进行二值化阈值处理，以突出高衰减区域。
将二值化的光学衰减图叠加到原始图像上，以标记死细胞区域（融合）。生成融合衰减图的三维渲染图像，以可视化死细胞区域的三维分布。
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结果
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 定制光谱域OCT成像系统 | |||
| 超发光二极管（SLD） | |||
| 2×2 个单模熔融光纤耦合器，50:50 分光比 | |||
| 参考臂 | |||
| 透镜管 | |||
| 适配器 | |||
| 准直透镜 | |||
| 聚焦透镜 | |||
| 运动镜架 | |||
| 镜面 | |||
| 一维平移台 | |||
| 连续中性密度滤光片 | |||
| 行人立柱 | |||
| 夹紧叉 | |||
| 样品臂 | |||
| 镜头筒 | |||
| 适配器 | |||
| 准直透镜 | |||
| 检流计 | |||
| 中继透镜 | |||
| 三角镜支架 | |||
| 镜面 | |||
| 目标 | |||
| 行人立柱 | |||
| 夹持叉 | |||
| 偏振控制器 | |||
| 30 mm 笼式安装座 | |||
| 笼杆 | |||
| 阶段 | |||
| 三维电动平移台 | |||
| 二维倾斜平台 | |||
| 旋转台 | |||
| 培养板支架 | |||
| 光谱仪 | |||
| 镜头筒 | |||
| 适配器 | |||
| 准直透镜 | |||
| 光栅 | |||
| F-theta 透镜 | |||
| InGaAs线阵扫描相机 | |||
| 细胞培养组分 | |||
| HCT 116 细胞系 | |||
| 细胞培养瓶 | |||
| 移液器 | |||
| 移液器吸头 | |||
| Gibco GlutaMAX DMEM | |||
| 胎牛血清，经认证，源自美国 | |||
| 抗生素-抗真菌素（100X） | |||
| 康宁96孔透明圆底超低吸附微孔板 | |||
| Gibco PBS，pH 7.4 | |||
| Gibco 胰蛋白酶-EDTA (0.5%) | |||
| Forma Series II 3110 水套式 CO₂ 培养箱2 培养箱 | |||
| 手套 | |||
| Parafilm | |||
| 移液管 | |||
| 离心 | |||
| 离心 | |||
| 显微镜 | |||
| 商用OCT设备列表 | |||
| SD-OCT系统 | |||
| SD-OCT系统 | |||
| 数据处理软件 | |||
| 基础图像分析 | |||
| 三维重建 | |||
| 3D 渲染 | |||
| OCT 采集软件 | |||
| 载物台控制 | |||
| OCT 处理软件 | |||
| 形态学与生理学分析 |
