使用原子力显微镜对从小鼠大脑中分离的多核糖体进行成像

Abstract

来源： Lunelli， L.， et.al. 用原子力显微镜观察脑多核糖体。J. Vis. Exp.（2016）.

该视频演示了使用原子力显微镜对多核糖体进行成像。镍离子涂层的云母片将 RNA 与附着的核糖体锚定在一起。样品经过洗涤、干燥并安装到显微镜载物台上。悬臂尖端扫描样品表面，记录激光偏转以映射拓扑结构。软件用于校正变形和可视化高分辨率多核糖体结构。

Protocol

注意： 为避免样品发生任何RNA降解，请使用DEPC处理过的水制备所有缓冲液，以尽量减少RNase污染。

1. 从全脑制备多核糖体

1. 收集脑组织（15分钟）
   1. 对野生型小鼠品系C57BL/6实施安乐死₂窒息5分钟。小心地从颅骨中解剖出大脑，将组织放入 1.5 ml 管中，并立即将其放入液氮中。在 -80 °C 下储存直至使用。
2. 裂解物的制备（30分钟）
   1. 用研钵和研杵在液氮下粉碎整个脑组织。
   2. 将约 25 mg 粉末转移到冷的微量离心管中，并立即（为避免粉碎组织解冻）加入 0.8 ml 裂解缓冲液 （见表 1） 并通过快速上下吹打 25 次来破坏细胞。
   3. 将试管在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 1 分钟以沉淀细胞碎片。
   4. 将上清液转移到新的微量离心管中，并在冰上保持管15分钟。
   5. 在4°C下以12,000 x g 离心管5分钟，以沉淀细胞核和线粒体。
   6. 将上清液转移到新的微量离心管中。
   7. 将上清液在 –80 °C 下储存最长 6 个月或立即使用。
3. 蔗糖梯度制备和离心（2小时30分钟）
   1. 用不含RNase的水（焦碳酸二乙酯处理水（DEPC-水）或商业水）和3%H₂O₂/DEPC H₂O 解决方案。
   2. 将试管放在冰上，并在每个试管的底部加入 5.5 ml 冷的 50% 蔗糖溶液（蔗糖溶液见 表 1）。小心地逐滴加入 15% 蔗糖溶液，保持靠近界面，以保持尖锐的界面，直到试管完全填充。当管子完全充满时，用橡胶塞将其封闭，以避免形成气泡。
   3. 在寒冷的房间里，轻轻地将管子水平放下，并保持在这个位置 2 小时。在此之后，慢慢将试管拉直回垂直位置并将它们放在冰上。渐变现在可以使用了。或者，使用常规梯度形成器制备 15-50% 蔗糖梯度。
   4. 在冷藏室中，小心地从梯度顶部取出 1.0 ml，并将蔗糖逐滴覆盖在胞质裂解物（即，在步骤 1.2 中获得的上清液）上。
   5. 小心地将试管放入水平转头的桶中。使用超速离心机在 4 °C 下以 180,000 x g 的速度离心梯度 100 分钟。
   6. {{TAG_162离心后，将试管在桶中在 4 °C 下放置 20 分钟以稳定梯度。
4. 蔗糖梯度分离（2小时）
   1. 小心地从超速离心机转子中取出一根超速离心管，并将其安装在密度梯度分离系统的收集装置上。收集1 ml级分，用紫外可见光检测器监测260 nm处的吸光度（见图1 上图）。将收集的馏分放在冰上。
   2. 准备 30-40 μl 目标级分的等分试样。将它们保存在冰上，然后再将它们储存在 -80 °C 直至使用。不要使用经过两个以上冻融循环的等分试样或蔗糖馏分（见图1下面板）。

2. 原子力显微镜样品制备（3小时）

1. {{TAG_208用胶带撕下云母片。
2. 用 DEPC 水清洗云母片 3-4 次，然后将其放入一个小培养皿中。然后用空气干燥表面。
3. 用 200 μl 1 mM NiSO₄ 覆盖云母，并在室温下孵育 3 分钟。
4. {{}}去除镍溶液，然后用空气干燥表面。通过将带有云母的培养皿置于冰上，在4°C下执行所有后续步骤。
5. 在冰上解冻 1.4.2 中获得的等分试样，然后将所有样品逐滴轻轻地加入云母中。使用 100-200 μl 吸头，将样品涂抹在云母的整个表面上。将样品在冰上孵育3分钟
{{}}
6. 用200μl冷缓冲液-AFM 逐滴覆盖云母片（见 {{}}表1）并在冰上孵育1小时。
7. 液体成像
   1. 小心地取出缓冲液-原子力显微镜（AFM），用200 μl冷缓冲液-AFM清洗云母片3-4次，以去除多余的蔗糖。然后，用冷洗涤液清洗云母片3次（见 表1），使云母表面覆盖一些微升的溶液。
   2. 转到第 3 点（图像采集）。
8. 在空气中成像
   1. 小心地取出缓冲液-AFM，用200 μl冷缓冲液-AFM洗涤云母3-4次，以去除多余的蔗糖。然后，用冷水洗涤液清洗云母 3 次（见 表 1），并用纸沥干多余的水。
   2. 将样品放在化学罩下晾干，培养皿顶部部分打开。2 小时后，关闭培养皿并在室温 （RT） 下储存。2-3 小时后测量样品，因为它们可以稳定数年。

3. 图像采集（热稳定后每张图像15分钟）

注：固定在云母上的多核糖体可以在空气或液体中使用交流模式成像。

1. 使用双面胶带将云母连接到样品架上。
2. 按照制造商的说明将样品架插入 AFM 载物台。在液体中成像时，如果可能，尽量将样品保持在低于 25 °C 的温度下，以增加多核糖体的稳定性。
3. 选择适合 AC 成像的悬臂，并按照制造商的说明将其安装在尖端支架上。在这里，使用力常数在 2-20 N/m 之间的悬臂进行空气成像，使用力常数在 0.1 N/m 左右的悬臂进行液体成像。
4. 调整悬臂上的激光点，并将象限探测器信号归零。
5. 选择合适的驱动频率，并以 10-20 nm 的振幅驱动悬臂。
6. 接近样品，直到尖端与表面啮合。
7. 选择 2x2 μm 的扫描区域，采集至少 512x512 像素图像（像素宽度< 4 nm），并选择实时背景扣除模式和 20-25 nm 的 Z 刻度。
8. 检查图像，寻找是否存在圆形物体，其特征是在空气中采集时高度在 10 到 15 nm 之间，在液体中采集时高度在 25 到 30 nm 之间，宽度在 25-30 nm 范围内。调整设定值和反馈参数，直到看到尖锐物体。在好的样品中，背景应该看起来相对平坦，有一些 2-4 nm 高的物体（见图 2A 和 B）。
9. 如果图像看起来不错（如第 3.8 点所示），请在不同的样品区域采集几次（至少 10 次）2x2 微米扫描。
10. （可选）。如有必要，获取所选多核糖体的高分辨率图像（见图2C）。
11. 应用软件校正（平面减法和逐行校正算法）来校正 AFM 图像，消除任意倾斜和漂移效果。

4. 数据分析（每张图片30分钟）

1. 优先使用无损压缩格式导出图像（可选：应用比例因子），例如TIFF格式（见图3A）。
2. 使用 ImageJ 宏工具集 RiboPick.ijm（复制到 ImageJ 宏/工具集子目录中）对多核糖体中的核糖体进行计数（见图 3B）并计算样本的统计特性（参见 图 3C）。
   1. 使用初始化程序的 工具开始加载图像。
   2. 使用标准 ImageJ <点选择>工具选择核糖体中心（shift + 左键单击允许多选核糖体）。使用 <标记核糖体> 工具标记选定的核糖体。核糖体坐标将显示在自定义文本窗口中。
   3. 向同一多核糖体中添加更多核糖体，重复第 4.2.2 点指示的过程。
   4. 使用<撤消最后一次选择>工具删除错误标记的核糖体（从上次添加的核糖体开始删除第一个核糖体 - 仅在当前多核糖体中）。
   5. 多核糖体完成后，使用 工具。当多核糖体编号作为叠加层添加到图像时，文本窗口会更新。
   6. 使用 写入核糖体坐标文件（使用图像的默认单位）和汇总选取的核糖体和多核糖体的 PNG 图像。原始图像将关闭而不被保存。

表 1.缓冲区。

100 μg/ml放线菌酰亚胺

缓冲区	组成	应用
裂解缓冲液	10 mM Tris–HCl，pH 7.5	裂解液的制备（1.1）
	10 mM NaCl
	10 mM MgCl{{}}2
TAG_601 TAG_600 TAG_599{TAG_602{TAG_609}}1% Triton-X100	{{}}
	1%脱氧胆酸盐钠
	0.4 u/ml RNase抑制剂
	1 mM DTT
	0.2 毫克/毫升环己酰亚胺
	5 u/ml Dnase I
50%蔗糖溶液	{{}}50% （w/v） 蔗糖	{{}}蔗糖梯度制备 （1.2）
	100 mM NaCl
	10 mM MgCl2
	10 mM Tris/HCl pH 7.5
15%蔗糖溶液	15% （w/v） 蔗糖在	蔗糖梯度制备（1.2）
	100 mM NaCl
	10 mM MgCl2
	10 mM Tris/HCl pH 7.5
镍溶液	1 mM NiSO4	原子力显微镜样品制备(2)
缓冲液-AFM	100 mM NaCl	AFM样品制备 （2）
	10 mM MgCl2
	100 μg/ml 环己酰亚胺
	{{}}10 mM Hepes
	3% （w/v） 蔗糖 pH = 7.4
洗涤溶液	DEPC-Water	AFM样品制备 （2）

{{}}{{}}{{TAG_978 TAG_979}}

Results

Materials