小鼠脑内脑海绵状血管畸形病变的增强对比微计算机断层成像

摘要

来源： Choi, J. P. et al. 小鼠模型中脑海绵状血管畸形的诱导与显微CT成像。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用显微CT成像技术对小鼠脑组织中的脑海绵状血管畸形（CCM）病灶进行可视化的方法。详细介绍了样本制备、成像及三维图像重建的步骤，以评估脑组织中CCM病灶的密度和位置。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 微型计算机断层扫描（CT）的样品制备

1. 通过二氧化碳窒息法对出生后第8天（P8）的新生幼鼠实施安乐死。
2. 使用装有3 mL含2%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）的10 mL注射器，插入29号针头至小鼠心室，进行心脏灌注。
   注意： 多聚甲醛具有毒性；操作时应穿戴适当的防护装备。
3. 使用剪刀将头部与身体分离。用剪刀去除头部所有皮肤，并用镊子剥离颅骨，以分离完整的大脑组织。
4. 使用体视显微镜在7.82倍放大倍数、1倍增益、0.6伽马值和20毫秒曝光时间下拍摄大脑图像。
5. 将分离的大脑组织置于含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定过夜。
   注意： 多聚甲醛具有毒性；操作时应穿戴适当的防护装备。
6. 次日，使用镊子分离脑干，并用PBS溶液清洗。
7. 将脑干在卢戈氏碘液中孵育48小时。
8. 孵育结束后，将脑干短暂置于空气中干燥，以去除多余的卢戈氏碘液。
9. 将经卢戈氏碘液染色的脑干装入0.65 mL微量离心管中，并用塑料封口膜完全密封，以防止组织收缩（图1A）。
10. 将微量离心管放入装有海绵的5 mL塑料管中，以防止扫描过程中发生移动（图1B）。

2. 小鼠脑内脑海绵状血管畸形（CCMs）的显微CT扫描

1. 将装在管中的小脑垂直安装在微计算机断层扫描（micro-CT）系统的铝制样品台上。
2. 设置扫描参数：采集540个投影，曝光时间为2秒，X射线源条件为50 kV和10 W，以获取断层数据集（图像分辨率为9.5 μm/像素）。
3. 扫描所得的放射图像由微CT系统提供的基于硬件的投影重建软件自动重建，生成16位轴向切片图像序列（“TXM”文件）。

3. 微计算机断层扫描（Micro-CT）数据集的分析

1. 在三维分析软件中打开重建的图像文件（“TXM”文件），并使用“体渲染”功能对脑组织进行可视化。
2. 使用“包围盒”和“裁剪平面”功能，将后脑调整至所需的方向。
3. 以扩展模式对变换后的图像进行重采样，并保持体素尺寸不变。
4. 在变换后的图像（3.3）上创建“新建标签域”，并利用灰度强度仅突出显示后脑区域。
5. 合并所有高亮区域，并运行“标签分析”以获取整个后脑的测量数据（即，总体积和总面积）。将测量结果导出为 Excel 文件。
6. 使用“等值面渲染”功能对后脑进行可视化。
7. 在变换后的图像上再次创建“新建标签域”，并利用灰度强度突出显示存在病变的区域。
8. 合并所有高亮区域，并运行“标签”分析以获取后脑内病变区域的测量数据（即，总体积和总面积）。将测量结果导出为 Excel 文件。
9. 使用“生成表面”和“表面视图”功能对病变区域进行可视化。
10. 在所需方向上截取后脑图像的快照，或生成视频以实现病变区域的三维可视化。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-羟基他莫昔芬	Sigma-Aldrich	H6278	用于激活 Cdh5-CreErt2
玉米油	Sigma-Aldrich	C8267-500ML	用于稀释 4-羟基他莫昔芬
体视显微镜	Leica	M205FA	用于拍摄宏观图像
卢戈氏碘液	Sigma-Aldrich	L6146	用于样本染色以增强显微CT对比度
塑料石蜡膜	Parafilm	PM992	用于封装样本
显微CT	Xradia	MicroXCT-400	显微CT
三维重建软件	FEI Visualization Science group	Avizo 3D 图像处理软件	用于分析显微CT扫描结果