1. 检测板、储备液和少突胶质前体细胞基础培养基的制备
注意： 本文所述的大鼠 OPC 基础（Sato）培养基源自先前已发表的研究。其他培养基配方也可能适用于本实验流程。
- 将聚-L-赖氨酸（PLL）用无菌去离子水重悬至浓度为 10 µg/ml。将 400 μl 稀释后的 PLL 加入黑色侧壁、透明底的 24 孔组织培养级培养皿的每个孔中。
- 在 37 °C 组织培养箱中孵育 2 小时，或在 4 °C 冰箱中过夜，以完成组织培养皿的包被。
- 在接种细胞前至少 20 分钟吸除包被后的培养皿中的 PLL。将 24 孔板盖子部分打开，置于组织培养超净台中，使残留的 PLL 溶液自然干燥。接种分离的少突前体细胞（OPC）前需确认各孔已完全干燥。若塑料表面存在液态 PLL，细胞将无法贴附。
- 配制 N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）储备液（1,000 倍）：将 100 mg N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）溶于 20 ml 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中。分装后于 -20 °C 保存。
- 配制氢化可的松储备液（1,000 倍）：向 1 mg 氢化可的松中加入 1 ml 乙醇，涡旋溶解。再加入 19 ml DMEM，混匀，分装后于 -20 °C 保存。已有研究表明，在基础培养基中添加氢化可的松可增强胶质细胞的存活率。
- 配制 d-生物素储备液（5,000 倍）：将 2.5 mg d-生物素溶于 50 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中。加入 1–2 滴（每滴 5 µl）0.1 N NaOH 以助溶解。分装后于 -20 °C 保存。
- 配制胰岛素储备液（100 倍）：将 25 mg 胰岛素溶于 50 ml 组织培养级水中。加入 250 µl 1 N HCl，混匀至溶液澄清。用 0.22 µm 滤器除菌，4 °C 保存，可使用长达 6 周。
- 配制 Sato 储备液（100 倍）：
- 配制孕酮储备液（25 µg/µl）：将 2.5 mg 孕酮溶于 100 µl 乙醇中。
- 配制亚硒酸钠储备液（400 ng/µl）：将 4 mg 亚硒酸钠溶于 100 µl 0.1 N NaOH 中。加入 10 ml DMEM 并混匀。
- 向 100 ml DMEM 中加入 1 g 人脱铁转铁蛋白、1 g 牛血清白蛋白和 160 mg 腐胺，混匀至完全溶解。再加入 25 µl 孕酮储备液和 1,000 µl 亚硒酸钠储备液，混匀。分装后于 -20 °C 保存。
- 配制 OPC 基础培养基：每 100 ml DMEM（含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和 110 mg/L 丙酮酸钠），加入 100 µl NAC、100 µl 氢化可的松、20 µl d-生物素、1 ml 胰岛素、1 ml Sato 储备液、100 µl 微量元素 B、2 ml B-27 补充剂（50 倍）、1 ml 青霉素/链霉素（100 倍）。用 0.22 µm 滤器除菌，4 °C 保存。
- 配制血小板源性生长因子 AA（PDGF-AA）储备液（1,000 倍）：将 250 μg 溶于含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 12.5 ml PBS 中，制成 20 μg/ml 溶液。分装后于 -80 °C 保存。
- 配制 OPC 增殖培养基：在 OPC 基础培养基中添加 20 ng/ml PDGF-AA。
- 配制 OPC 分化培养基：在 OPC 基础培养基中添加 45 nM 三碘甲腺原氨酸。
- 配制层析缓冲液：向 500 ml PBS 中加入 2.5 g BSA 和 2 ml 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA），调节 pH 至 7.2。用 0.22 µm 滤器除菌，4 °C 保存。
2. OPC 分化的诱导及使用 4% 多聚甲醛固定
注意：在检测小分子对少突胶质发生的影响时，我们通常将药物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制1,000倍浓缩储备液，储存于-80 °C，使用时直接稀释至SATO培养基中，最终DMSO浓度为0.1%。我们未观察到该浓度的DMSO对少突胶质前体细胞（OPC）的增殖或分化产生任何影响（数据未显示）。
- 将 OPC 基础培养基预热至 37 °C，并将药物处理储备液解冻至室温。若需进行重复实验，每个处理组在 1.5 ml 离心管中准备约 1.25 ml 培养基；对于三重复样本，使用 2 ml 容量的离心管以预留余量。
- 通过将处理储备液直接稀释至 OPC 基础培养基中，为重复孔制备处理母液。短暂涡旋或轻轻混匀每种母液，以确保处理成分均匀分布。
- 制备 45 nM 三碘甲腺原氨酸（T3）作为阳性对照，并选择适当的溶剂作为阴性对照。将 10 mM T3 储备液在 1 ml OPC 基础培养基中按 1:1,000 比例稀释，然后进一步在处理母液中稀释，以必要时降低 DMSO 的终浓度。
- 逐个处理组吸除培养孔中的培养基，以避免细胞干燥。在玻璃巴斯德吸管末端使用 200 µl 枪头，以避免刮下孔壁上的黑色物质并混入培养物中。
- 使用 1 ml 移液枪沿孔壁缓慢加入 500 µl 处理母液。
- 将培养物在所需时间范围内孵育，每 2–3 天用新鲜处理培养基完全更换一次。我们通常在分化培养基中培养 4 天后观察到 30–40% 的 MBP+ 细胞比例。
- 在所需处理期结束后，配制新鲜的 4% 多聚甲醛（PFA）或将冷冻储备液解冻至室温。注意： PFA 具有极高毒性，必须在通风橱中配制。
- 吸除培养基，并沿孔壁缓慢加入 400 µl PFA 以固定细胞。在室温下孵育 20 分钟。
- 吸除 PFA，并沿孔壁缓慢加入 500 µl 无菌 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（D-PBS，含 Ca2+ 和 Mg2+）以洗涤细胞。总共重复洗涤两次。最后一次洗涤液不要吸除。
- 用封口膜包裹培养板，于 4 °C 保存以备后续处理，或直接进入下一步操作。培养板可保存数周。
3. 免疫细胞化学与髓鞘碱性蛋白的定量分析
注意： 在24孔板上进行液体操作时，建议操作迅速，以避免细胞干燥。此处推荐使用多通道真空吸液器和多通道移液器。
- 将培养板恢复至室温，吸去孔内液体，每孔加入 250 μl 含 0.1% Triton X-100 和 5% 正常山羊血清（NGS）的 D-PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）。在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
- 在含 5% NGS 的 D-PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）中，按 1:1,000 稀释小鼠单克隆抗 MBP 抗体，按 1:200 稀释兔多克隆抗肌动蛋白（Actin）抗体，配制一抗孵育液。或者，在混合胶质细胞培养物中，可使用 1:1,000 稀释的兔多克隆抗 Olig2 抗体进行少突胶质细胞特异性归一化。按每孔 250 µl 的量准备足量的一抗溶液。
- 将一抗在 4 °C 下孵育过夜，时间为 16–18 小时，并保持轻柔振荡。
- 吸去一抗孵育液，在室温下用 500 µl D-PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）轻轻振荡洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 在洗涤培养板的同时，于含 5% NGS 的 D-PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）中按 1:500 稀释抗小鼠 680 和抗兔 800 二抗。配制该溶液时应尽量避免环境光暴露。
- 吸去最后一次洗涤液，每孔加入 250 µl 二抗孵育液。避光孵育，在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
- 吸去二抗孵育液，在室温下用 500 µl D-PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）轻轻振荡洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 使用可检测 700 nm 和 800 nm 荧光发射的成像系统扫描培养板。初始设置时，将焦平面偏移设为 3，MBP 的灵敏度设为 1.5，Actin 设为 5.0，Olig2 设为 3.5。根据需要调整灵敏度，避免信号过曝。
- 使用基于软件的半自动化方法定量分析少突胶质生成的程度。
- 在软件中将培养板分析模式设为“24 孔”，并在扫描图像的各孔外周对齐圆形区域。将归一化通道设为“800”，导出 700 nm（MBP）和 800 nm（Olig2/Actin）通道的总荧光强度和相对荧光强度。
- 将 700 nm 处的荧光强度除以 800 nm 处的强度，得到以相对荧光单位表示的归一化 MBP 表达量。计算重复测量值的平均值，并根据分析需要将表达量相对于 Day 0 +PDGF 对照组进行标准化。
