表皮内神经纤维中线粒体的可视化

来源： Hamid, H. S., et al．人类表皮内神经纤维中线粒体的三维成像与分析． J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了利用三维成像技术可视化神经特异性线粒体的方法。该方法包括对预先标记的表皮内神经纤维进行连续扫描，并生成三维表面图像，以分离并显示线粒体与神经结构之间的关系。

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 共聚焦成像

进行共聚焦成像：
1. 使用倒置显微镜上的40倍油浸物镜（数值孔径（N.A.）为1.25）配合激光扫描共聚焦显微镜采集图像。
  1. 在每个焦平面上依次采集荧光信号：
    细胞核：激发波长 λ = 405 nm，光谱发射滤光片波长 λ = 420 - 480 nm
    神经纤维：激发波长 λ = 488 nm，光谱发射滤光片波长 λ = 505 - 560 nm
    线粒体：激发波长 λ = 543 nm，光谱发射滤光片波长 λ = 606 - 670 nm
2. 在显微镜软件中输入以下扫描参数：扫描速率为600 Hz，帧平均数为2，放大倍数为2.2；强度分辨率为12位（4096个灰度级）。
  1. 设置显微镜软件以优化横向分辨率（扫描分辨率为1,024 × 1,024）和轴向分辨率/光学切片能力（共聚焦孔径为1艾里单位（AU），z轴步长为210 nm）。
    注意：最终的XYZ分辨率为172.2 nm × 172.2 nm × 210 nm，图像尺寸为176.1 µm × 176.1 µm × 30–50 µm。
3. 对神经信号（绿色荧光）启动实时扫描，并调节显微镜软件中的z轴聚焦控制，确定并设定包含组织切片内神经信号的上下焦平面。对于50 µm厚的组织切片，总z轴范围通常为30–50 µm。
4. 在实时扫描过程中，使用显微镜软件旋转扫描视野，使表皮在图像中呈水平或垂直方向排列。
5. 分别扫描每种信号，并调节探测器（光电倍增管，PMT）的电压和偏移，以最小化或消除过饱和和欠饱和像素。
  注意： 使用上述参数的扫描时间约为20–40分钟，具体时长取决于z轴切片的数量。

2. 人类表皮内神经纤维中线粒体的三维可视化与分析

分离三维表皮：
1. 复制原始图像，并使用图像的最大强度投影（扩展焦面视图）来识别并分离表皮。
2. 使用感兴趣区域工具沿表皮的上、下边缘进行描记，以去除无表皮内神经纤维的无关区域，如角质层和真皮层。对选定区域进行裁剪。
对神经和线粒体荧光信号进行去卷积处理：
注意： 去卷积有助于恢复荧光信号的完整性。本方案中使用的恢复方法称为盲去卷积，因为它利用图像中的荧光信号来确定信号从其原始源扩散的程度（点扩散函数）。该过程通过将扩散的信号重新分配至其原始位置，从而提高信号分辨率。
1. 根据以下参数，为绿色荧光神经信号（green-fluorescence）计算点扩散函数（PSF）：
  1. 将计算的PSF设为共聚焦模式。介质折射率设为1.515，数值孔径设为1.25。探测器针孔设为1 AU。激光激发波长设为488 nm，发射波长设为515 nm。
2. 根据以下参数，为红色荧光线粒体信号（red-fluorescence）计算PSF：
  1. 将计算的PSF设为共聚焦模式。介质折射率设为1.515，数值孔径设为1.25。探测器针孔设为1 AU。激光激发波长设为543 nm，发射波长设为617 nm。
3. 使用上述相应的PSF，并设置迭代恢复功能为100%置信度和最多10个循环，对神经和线粒体的荧光信号进行去卷积优化。
创建神经特异性表面：
1. 使用“创建表面”工具，从去卷积后的绿色荧光二次标记蛋白基因产物9.5（PGP9.5）所识别的神经中生成神经的实体表面。
2. 取消勾选“平滑”功能，并使用绝对强度功能设置神经信号的阈值，因为其荧光强度显著高于背景。
3. 使用绝对强度功能设置神经信号的阈值，因为其荧光强度显著高于背景。将阈值设得足够低，以准确识别神经。
4. 根据大小过滤掉小的非神经表面。
  注意： 如有必要，可在“编辑”选项卡中手动删除额外的非神经表面：按住 CONTROL 键以高亮多个对象，然后使用 Delete 键将其删除。
分离神经特异性荧光线粒体信号：
1. 选择神经表面的“编辑”选项卡，查看“掩膜属性”功能。所创建的神经表面用于将神经内的线粒体信号与角质形成细胞相关的线粒体信号分离开。
2. 当“全部掩膜”按钮打开“掩膜通道”窗口时，在“通道选择”下拉菜单中选择去卷积后的红色荧光信号作为线粒体信号。
3. 勾选“应用掩膜前复制通道”选项。
4. 在“掩膜设置”中点击“常量内部/外部”选项前的单选按钮，并勾选“将表面外部体素设为”选项，输入值为0.00。点击“确定”按钮，生成代表神经表面内线粒体信号的新通道。
创建线粒体特异性表面：
1. 使用“创建表面”工具，从新生成的神经特异性线粒体荧光通道中创建线粒体的实体表面。
2. 取消勾选“平滑”功能，并选择“背景扣除”功能来设置阈值。该功能利用线粒体信号周围的局部对比度，将线粒体与背景区分开。
3. 将阈值设得足够低，以准确识别线粒体。本示例中，在16位（65,536）尺度下，下限阈值设为2,000。
4. 根据大小过滤线粒体表面。本示例中，体素限制设为1.0体素，即最低可能限值。如有必要，可在“编辑”选项卡中按住 CONTROL 键选择多个对象，然后使用 Delete 键手动删除非线粒体表面。
  注意： 有时软件会生成与可辨别的荧光线粒体信号无关的表面。在此类情况下，可通过“编辑”选项卡将其移除。

姓名	公司	目录编号	评论
Leica SP5 激光扫描共聚焦显微镜	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5
Volocity x64 软件	Perkin Elmer, Waltham , MA	版本 4.4.0	Volocity 软件用于图像处理
Imaris x64 3D 分析软件	Bitplane, Concord, MA	版本 7.7.1	Imaris 软件用于图像分析

表皮内神经纤维中线粒体的可视化

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