来源： Ishimoto, H. et. al.,利用离体钙成像技术可视化果蝇脑对内分泌信号的响应。J. Vis. Exp. (2018)
本视频演示了利用钙成像技术研究Drosophila脑神经元对神经肽的响应。表达荧光钙指示剂的神经元可揭示细胞内钙离子动态变化及其对信号分子的功能性反应。
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方法文章
离体钙成像研究Drosophila脑对神经肽的反应
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2025年5月29日
本文内容
摘要
方案
1. 幼虫脑外植体的制备
- 制备成像室。
注意： 稳定记录要求脑外植体被固定。此处，在 Ca2+ 成像系统中使用一种低成本、手工制作的成像室。- 使用镊子在塑料培养皿（35 mm × 10 mm）底部中央轻轻刮擦，形成一个凹陷，用于容纳幼虫脑的腹神经节，以便于后续固定（步骤 1.3，图 1）。
- 用牙签在凹陷两侧各放置一小滴瞬干胶，并将一根钨丝（直径 0.125 mm，长度 6 至 7 mm）粘附于胶上。
- 使用一小块类似橡皮泥的可重复使用粘性材料，在凹陷周围制作一个圆形围壁（直径 10 mm，高 3 mm）（图 1）。
注意： 围壁内部空间后续将填充磷酸盐缓冲液（PBS；0.14 M 氯化钠（NaCl），0.0027 M 氯化钾（KCl），0.01 M 磷酸根离子（PO43–），pH 值为 7.4 ± 0.05（25 °C 下）。
- 动物准备
注意： 进行钙成像时，目标细胞类型中需表达钙指示剂 GCaMP6s，通常通过组织特异性 GAL4 与 UAS-GCaMP6s 的组合实现。为确保信号通过候选受体介导，还需在该受体缺陷的突变体中表达 GCaMP6s。- 当需要对不同基因型（如野生型与突变体）进行实验比较时，应使测试幼虫的年龄相匹配，以避免因发育阶段不同导致的 GCaMP6 表达水平差异及生理差异。
- 将亲代果蝇（每性别各 30 只）置于含标准果蝇食物的培养管中，放置 8 小时以允许其在食物表面产卵。在 25 °C、60–70% 相对湿度及 12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下大规模培养幼虫。
- 幼虫脑解剖
- 在产卵后90–120小时，收集幼虫，并用蒸馏水至少清洗3次，以去除附着的食物残渣。
- 将一只幼虫置于盛有冰冻PBS的1.5英寸方形表面皿中。
注意：接下来的两个步骤需在解剖显微镜下，于该表面皿中进行。 - 用镊子轻轻夹住幼虫的中段，再用另一把镊子夹住口钩，轻柔地拉出口钩，将包含脑的幼虫前部与身体其余部分分离。
注意：也可使用手术剪刀。 - 用镊子夹住前段末端，将幼虫翻转至内翻状态。去除附着在脑上的多余组织，例如成虫盘、脂肪体和环腺。轻柔地将脑与口器部分分离。
- 向成像室中由可重复使用的橡皮泥状粘合剂形成的环内侧加入200 µL PBS。用巴斯德移液管轻柔吸取含有解剖所得脑组织的PBS，然后将其转移至成像室中。
- 将脑组织置入成像 chamber
- 使用镊子夹住从腹神经节延伸出的肌肉纤维。将脑组织轻轻插入钨丝下方的凹槽内。
- 使用另一把镊子，轻微向上提起钨丝，以将脑组织调整至适合成像的正确位置（图 1）。
2. 钙离子的获取2+ 荧光图像
注意：将脑组织外植体浸入 PBS 中，使用配备 20 倍水浸物镜（数值孔径，N.A. = 0.5）的荧光显微镜进行成像。PBS 不会激活脑组织中的细胞。若需获取 Z 轴图像，物镜需配备压电驱动的镜头移动装置。采用转盘共聚焦成像头以提高时间分辨率。对于弱光成像，显微镜上安装有电子倍增电荷耦合器件相机。GCaMP6s 荧光成像（激发/发射：488/509 nm）需使用 488 nm 激光激发，并配合二向色镜和发射滤光片（例如，528 ± 38 nm 带通滤光片）。
- 将含有脑组织外植体的成像室置于显微镜下。
- 将物镜降低至接触PBS。在明场照明下，调整脑组织位置并使其对焦。切换至荧光照明，并对GCaMP6s标记的细胞进行调焦。
注意： GCaMP6s 的基础绿色荧光应可见。 - 使用适当的采集软件，在水冷模式下以 250 ms/帧的速度、512 × 512 像素的分辨率开始采集例如，µManager）。调整曝光时间，使荧光值处于电荷耦合器件（CCD）相机的动态范围内，但不低于1000（任意单位），适用于16位图像（动态范围0-65,535）。
注意： 应使用较短的曝光时间以尽量减少GCaMP6s的光漂白。曝光时间应在每次实验中进行优化，因其取决于GCaMP6的表达水平和检测系统的灵敏度。在本实验中，使用GCaMP6时曝光时间为100 ms。 dilp2>GCaMP6s 当特定成像深度需要进行z轴层扫描时，可根据曝光时间和帧间隔获取多个z轴层面的图像。若相机具备足够的空间分辨率，应增大合并像素（binning）尺寸（即芯片上合并为一个数字像素的寄存器数量），以缩短曝光时间。 - 确定成像参数后，在给予肽之前采集1分钟图像以检测基础信号强度（F0).
- 加入测试肽；具体操作为，将100 µL肽溶液溶于PBS中，直接用移液器加入幼虫浴液，以达到最佳浓度。
注意： 肽溶液应缓慢注射（例如，使用移液器以20 µL/s的流速将溶液注入浴液中。以溶于PBS的无关合成肽作为阴性对照。 - 记录 GCaMP6s 发射信号数分钟。
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结果
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 钨棒 | |||
| 蓝丁胶 | |||
| 方形表面皿，1 5/8 英寸 | |||
| PBS | |||
| CCHa2 | |||
| Ghrerin | |||
| Nociceptin | |||
| Axio Imager A2 | |||
| 水浸物镜 W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | |||
| P-725 PIFOC 长行程物镜扫描器 | |||
| 共聚焦扫描单元 CSU-W1 | |||
| ImagEM C9100-13 | |||
| OBIS 488 nm LS 60 mW | |||
| 488/568/647 nm Yokogawa 二向色分光镜 | |||
| 528/38 nm BrightLine 单通带带通滤光片 | |||
| µManager |
