小鼠脑切片中室管膜细胞纤毛活动的活体成像

摘要

来源： Al Omran, A. J., et al．小鼠脑侧脑室室管膜纤毛的活体成像．J. Vis. Exp. (2015)．

本视频展示了一种活体成像技术，利用微分干涉差显微镜（DIC）观察小鼠脑组织矢状切片中室管膜纤毛的跳动。室管膜纤毛可推动脑脊液（CSF）流动，其活动在富含营养的培养基中维持的脑切片内进行记录，并在环境可控的成像室内完成观察。高对比度视频有助于识别具有功能活性的纤毛，并可对其跳动频率进行定量分析。

方案

所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 脑组织提取、切片与组织制备

1. 通过 CO₂ 窒息法深度麻醉 5 分钟，处死野生型 C57BL/6 小鼠。通过颈椎脱位确认死亡。
2. 用 70% 乙醇清洁小鼠头部。
3. 使用无菌剪刀和镊子进行开颅手术，首先从头部顶部开始剥离皮肤，暴露颅骨。
4. 颅骨暴露后，从后侧开始向前侧逐片剥离骨片以去除颅骨。注意避免破坏脑室结构。
5. 取出完整的大脑组织。
6. 将大脑置于盛有预热至 37 °C 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/高糖培养基的 100 mm 培养皿中，该培养基添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素溶液（含 10,000 单位/ml 青霉素和 10,000 µg/ml 链霉素）。
7. 用手持锋利刀片沿正中矢状面切开脑组织，并使用振动切片机从每半脑获取最初的 100–200 mm 切片。
8. 用预热至 37 °C 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗脑组织。
9. 立即将脑切片放入预热至 37 °C 的 DMEM/高糖培养基中。

2. 活细胞成像配置与设置

1. 将脑组织切片置于含有1 ml DMEM/高糖培养基的30 mm玻璃底培养皿中。调节显微镜封闭腔室环境至37 °C、95%/5% O₂/CO₂ 条件（图1）。
2. 使用60倍油浸物镜，在60倍物镜上滴加一滴浸油，通过常规微分干涉差（DIC）透射光对细胞进行对焦，采集室管膜细胞/纤毛图像。
3. 随后，以DMEM中气泡的移动方向为指引，确定运动性室管膜纤毛的位置，因为纤毛摆动会在局部产生类似气泡移动的现象。使用DIC滤光片选择脑侧脑室中包含健康细胞且具有运动纤毛的区域。一旦找到室管膜纤毛，调节光照与焦距，以获得满意的图像。
4. 使用Metamorph成像软件，根据特定实验目的设置实时成像参数。在本演示中，使用相机1×1 binning模式、60倍物镜以及5–10毫秒曝光时间，采集24位图像。
5. 将显微镜光圈调节至最佳水平，以实现最短曝光时间，采集DIC图像。观察实时传输至相机的图像，实现快速、即时的图像采集，无延迟。根据获得足够图像对比度所需的最短曝光时间，计算纤毛摆动速度。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/高糖	Cellgro Mediatech 公司	10-013-CV
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH30088-03
青霉素/链霉素	Thermo Scientific	SV30010
磷酸盐缓冲液	Thermo Scientific	SH30256-01
振动切片机	Leica Biosystems	Leica VT1200S
细胞培养板	VWR Vista Vision	30-2041
倒置荧光显微镜	Nikon	Nikon TE2000	60X 油镜