使用连续块面扫描电子显微镜对神经元线粒体进行成像

摘要

资料来源：Mukherjee， K.， et.al. 使用连续块面扫描电子显微镜分析脑线粒体。J. Vis. Exp. （2016）

该视频演示了准备工作， 使用连续块面扫描电子显微镜 （SBFSEM） 对小鼠脑组织进行成像和分析，以可视化线粒体超微结构，从而能够精确绘制它们在轴突和树突神经元区室中的形态和空间分布。

方案

所有涉及动物样本的程序均已经过适当动物伦理审查委员会。

1. 脑组织和 SBFSEM 成像的准备

1. 按照机构指南使用 4 - 5% 异氟醚麻醉一只年轻（~2 - 4 个月大）C57 黑色小鼠（C57BL/6J 菌株）。通过监测肌张力丧失、缺乏自主运动和对厌恶刺激（如捏尾巴）的反应来确认麻醉。
2. 注意：注意：^oC.
3. 注意： 。
4. 注意：₂O （dH₂O）。将亚铁氰化钾溶液放在冰上。使用前，加入 10 ml 4% 四氧化锇 （OsO₄）。
5. ₂O.
6. ₂₂O.
7. ₄ dH 到 2%₂O，然后用 2% 的四氧化锇水溶液孵育 1 小时对组织进行染色。组织 3 次，每次 5 分钟，dH₂O.
8. ₂O。
10. 将 0.998 g L-天冬氨酸溶解在 250 ml dH 中₂O 然后逐滴添加 10 N 氢氧化钾 （KOH），直到 pH 值达到 5.5。调节 pH 值后，在 10 ml 天冬氨酸原液中加入 0.066 g 硝酸铅，并加热至 60 °C 30 分钟。

₂₂O.

注意：注意：注意：注意：2. 分析成像数据集

注意：Image J/Fiji 软件用于分析数据集，并依赖于 TrakEM2 插件。预处理步骤可以使用各种软件执行，并且可能很广泛或很小，具体取决于经验水平和获得的堆栈。此处描述了使用开源软件（ImageJ ver 1.50b，斐济下载，2015 年 10 月 1 日）的主要转换。

1. 打开软件并选择菜单项 Image→Type→8 bit，将图像从原始专有的 16 位图像转换为 8 位 tiff 格式。
   1. 如果此步骤中的自动对比度/亮度转换对于图像不理想，请重新打开 16 位图像，然后按 Image→Adjust→Brightness/Contrast。选择适用于所有图像的范围，然后按 应用.然后执行转换。注意： 在某些SEM上，此步骤可能需要显微镜制造商软件。
   2. 例如注意：
   3. 如果需要，请在注册之前放大画布大小 （Image→Adjust→CanvasSize） 或将其缩小到感兴趣的区域 （Image→Crop）。
      注意：'例如。ImageJ/FIJI，插件→Registration→ManualLandmarkSelection）。
2. '例如. 25%）使用 ImageJ （Image→Scale）。

材料