使用连续块面扫描电子显微镜对神经元线粒体进行成像

摘要

来源： Mukherjee, K., et. al. 利用连续块面扫描电子显微镜分析脑线粒体。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用连续块面扫描电子显微镜（SBFSEM）对小鼠脑组织进行制备、成像和分析的方法，以观察线粒体的超微结构，从而精确描绘其在轴突和树突神经元区室中的形态特征与空间分布。

方案

所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 脑组织制备与SBFSEM成像

1. 使用4-5%异氟烷按照机构指南麻醉一只年轻的（约2-4个月大）C57黑鼠（C57BL/6J品系）。通过监测肌肉张力丧失、无自主运动以及对尾部夹捏等厌恶刺激无反应来确认麻醉效果。
2. 将小鼠固定于解剖托盘上，沿腹侧中线在皮肤上做一剪口。进一步剪开皮肤以暴露小鼠的肋骨 cage。剪开膈肌，沿胸腔周围仔细解剖以暴露跳动的心脏，然后在右心房处做一剪口。
3. 使用蝴蝶针头穿刺左心室。经心脏灌注10 - 20 ml磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2），直至肝脏颜色改变证实血液排尽。
   注意： 通过观察肝脏颜色的变化来判断放血程度。确认肝脏颜色由红褐色变为淡粉色。
4. 通过心脏灌注10–20 ml含2%戊二醛和4%多聚甲醛的0.10 M卡可基酸盐缓冲液（pH 7.2），对小鼠进行原位快速固定，以充分固定脑组织。通过观察尾部僵硬程度来监测固定效果。
   注意： 将2.14 g二甲胂酸钠溶于80 ml水中，加入盐酸调节pH至7.2，再加水定容至100 ml，制备0.10 M二甲胂酸缓冲液（pH 7.2）。
5. 灌流后，处死小鼠并取出脑组织，随后在含2%戊二醛和4%多聚甲醛的0.10 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）中于4 °C固定48 h ^oC.
6. 48 小时后进行 400 µm 使用振动切片机切取冠状切片，然后在解剖显微镜下仔细分离脑内目标区域（例如海马）。小心修整组织，并拍摄照片以保留方位信息。
   注意： SBFSEM中组织染色的后期处理方法结合了多种重金属染色技术，以提高分辨率。 .
7. 用0.1 M卡可基酸盐缓冲液（pH 7.2）清洗经戊二醛固定的组织3次，每次5分钟。
8. 将鞣酸溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）中，配制 0.1% 鞣酸溶液。轻轻摇动至溶解，随后经滤膜过滤 0.45 µm 必要时过滤。
9. 用1 ml含0.1%单宁酸的卡考基酸盐缓冲液在室温下孵育30–60分钟，对组织进行后固定。
   注意： 孵育时间取决于组织大小，但大多数组织以30分钟为宜。
10. 用卡考迪酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤组织3次，每次5分钟。
11. 将0.3 g铁氰化钾和0.86 g二甲胂酸钠溶于10 ml蒸馏H₂O (dH₂O）。将亚铁氰化钾溶液置于冰上。使用前立即加入10 ml 4% 四氧化锇（OsO₄).
12. 在冰上用2%的锇酸-铁氰化钾溶液染色90分钟，用去离子水洗涤3次，每次5分钟。₂O.
13. 将0.1 g TCH溶于10 ml dH₂O中，配制1%硫代羰基肼（TCH）溶液₂O. 溶解于 60 °C 每10分钟轻轻摇动一次，直至完全溶解。操作TCH时需遵守安全防护措施，特别注意避免使用金属、高温加热或使溶液干涸。
14. 用新鲜配制的1% TCH在室温下处理样品20分钟。在dH₂O中洗涤3次，每次5分钟。₂O.
15. 稀释4% OsO₄₄ 至2% dH₂O，将组织在2%的水性四氧化锇溶液中孵育1小时进行染色。用去离子水洗涤组织3次，每次5分钟₂O.
16. 在 dH₂O 中用 1% 醋酸铀酰对样品孵育过夜₂O 在 4 °C.
17. 制备Walton's铅天冬氨酸溶液。
    1. 将0.998 g L-Aspartate溶于250 ml dH₂O中₂O，然后逐滴加入10 N氢氧化钾（KOH），直至pH达到5.5。pH调节后，在10 ml天冬氨酸储备液中加入0.066 g硝酸铅，并加热至 60 °C 30分钟
18. 用去离子水冲洗组织₂O，并在 Walton 的铅天冬氨酸染色液中孵育 30 分钟 60 °C 烤箱。用去离子水洗涤3次，每次5分钟₂O.
19. 使用预冷的20%、50%、75%、85%和95%乙醇溶液梯度脱水，每种浓度各5分钟，随后用100%乙醇处理3次，每次10分钟。
    注意： 使用新开封瓶装的100%乙醇，因为开封后的乙醇会从空气中吸收水分，导致包埋失败。对于较大的组织样本，需要更长的孵育时间。
20. 用丙烯氧化物清洗样品 2 次，每次 15 分钟。
21. 使用25 ml树脂、10.5 ml DDSA（十二烯基琥珀酸酐）、15.5 ml NMA（纳迪克甲基酸酐）和1 ml DMP-30（2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚）配制塑料包埋树脂。通过振荡混合树脂，离心后静置至气泡完全消失。
    注意： 这是标准硬度的介质配方。也可使用其他类型的电子显微镜（EM）塑料树脂，但应提前使用非关键性的对照样本进行测试，因为并非所有树脂均适用于SBFSEM。
22. 将组织在含有50:50包埋树脂与环氧丙烷混合液的离心管中孵育过夜，离心管开始时加盖，2小时后去除盖子，使环氧丙烷在约8–10小时内逐渐挥发。
23. 将组织转移至洁净小瓶中的100%新鲜包埋树脂中，孵育2小时。
24. 将样品包埋于新鲜的包埋树脂中，置于含有打印纸标签的平底模具内，并在烘箱中固化 60 °C 48 小时。约 1 小时后，再次检查组织的位置和对齐情况，并根据需要进行调整。
25. 将样品修剪至目标区域，使用凝胶型氰基丙烯酸酯超级胶水或导电环氧树脂将其固定在铝制样品钉上。随后，在样品块侧面涂覆胶体银导电漆，以提供通往铝制样品钉的导电通路。
26. 使用配备腔内超薄切片机载台和低电压背散射电子探测器的扫描电子显微镜系统检查组织样本。
    注意： 获取扫描电子显微镜（SEM）使用相关的仪器和场地培训，并成为授权使用者。或者，对于小型项目，可考虑与研究人员或核心设施开展合作。由于扫描电子显微镜会产生X射线，可能还需接受辐射安全培训。
27. 成像样本时，使用以下设置：2.25 kV，分辨率为 5 - 10 nm/像素，视场尺寸介于 80 - 250 µm 在 x、y 方向（可选择其他视场大小），切片厚度为 50 - 100 nm，总切片数为 250 - 600 片，耗时 16 - 20 小时。
    注意： 不同显微镜、不同样品以及所需分辨率之间的设置差异很大。这些设置应能生成适用于多种样品的清晰可辨图像。

2. 分析成像数据集

注意：使用 ImageJ/Fiji 软件分析数据集，并依赖 TrakEM2 插件。预处理步骤可使用多种软件完成，具体操作的复杂程度可能因操作者经验水平和所获得图像堆栈的质量而异。本文所述主要使用开源软件（ImageJ 版本 1.50b，FIJI 下载日期为 2015 年 10 月 1 日）进行的处理步骤。

1. 通过打开软件并选择菜单项“图像→类型→8位”，将原始的16位专有格式图像转换为8位TIFF格式。
   1. 如果在此步骤中自动的对比度/亮度转换对图像效果不理想，请重新打开16位图像，然后按“图像→调整→亮度/对比度”。选择适用于所有图像的范围，点击“应用”，再执行转换。注意： 某些扫描电镜可能需要使用显微镜制造商提供的专用软件完成此步骤。
   2. 如因切片间图像移动过大（例如，因电荷积累导致的漂移）而需要校正，请对图像堆栈进行配准/对齐（菜单项：插件→配准→Linear StackAlignmentWithSIFT）。在大多数配准软件中，应设置为“仅平移”模式，而非“刚体”模式。
      注意： 多种方法和软件均可实现：SIFT配准插件适用于多数应用场景，且存在虚拟堆栈版本。
      1. 如需要，在配准前可扩大画布尺寸（图像→调整→画布大小），或将其裁剪至感兴趣区域（图像→裁剪）。
         注意： 可能仍存在部分漂移或散开现象，尝试其他插件或软件可能获得更优结果。也可采用手动方式（例如，ImageJ/FIJI，插件→配准→ManualLandmarkSelection）。
   3. 如需要，可使用ImageJ（图像→缩放）将图像缩放至更小、更易处理的尺寸（例如，25%）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	664
异氟烷	VETone，商品名 Fluriso	501017
解剖托盘	Fisher Scientific	S65105
解剖剪	Ted Pella Inc.	1316
蝴蝶针	Exel International	26704
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
滤膜（0.45 微米）	EMD Millipore	NC0813356
解剖显微镜	Olympus	SZ61
振动切片系统	Ted Pella Inc.	Vibratome 3000
二甲胂酸钠	EMS	12300
单宁酸	EMS	21700
亚铁氰化钾	J.T. Baker	14459-95-1
四氧化锇 4% 溶液	EMS	19150
硫代碳酰肼	EMS	21900
L-天冬氨酸	Sigma-Aldrich	A93100
氢氧化钾	Acros Organics	43731000
硝酸铅	EMS	17900
EMbed-812 包埋试剂盒	EMS	14120	包含 Embed 812 树脂、DDSA、NMA 和 DMP-30。
25% 电镜级戊二醛	Polysciences Inc.	1909
多聚甲醛	EMS	19202
醋酸铀酰	EMS	22400
乙醇	EMS	15055
丙烯氧化物	EMS	20400
包埋模具	EMS	70907
铝制样品针	EMS	70446
胶体银液体	EMS	12630
剃刀	EMS	72000
超级胶水（Loctite Gel Control）	Loctite	234790
导电环氧树脂	Ted Pella Inc.	16043
扫描电子显微镜	蔡司	Sigma VP
用于扫描电镜的腔内超薄切片机	Gatan 公司	3View2	可针对其他扫描电镜进行设计
用于针头制备的修整显微镜	Gatan 公司	作为3View系统的一部分提供
低电压背散射电子探测器	Gatan 公司	3V-BSED
ImageJ/Fiji 处理软件包	ImageJ 版本 1.50b，FIJI 下载于 2015 年 10 月 1 日		http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
			http://rsb.info.nih.gov/ij/
			http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
			http://fiji.sc/TrakEM2