通过荧光示踪鉴定小鼠视网膜神经节细胞亚型

摘要

来源： Laboissonniere, et. al．视网膜神经节细胞特定亚群的单细胞RNA测序．J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了一种荧光示踪技术，用于在转基因小鼠视网膜中鉴定视网膜神经节细胞（RGC）亚型。该过程包括将分离的视网膜固定在记录室中，通过充氧灌流维持细胞活性，并使用含有示踪剂的移液管靶向荧光标记的RGC。通过分析树突形态及其分层特征，该方法可实现不同RGC亚型的分类。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审查并批准。

1. 视网膜组织的制备（2 小时）

注意： 本节中的所有操作均应在红光弱光条件下进行

1. 解剖前至少将动物暗适应 1 小时。所有操作均需在微弱红光照明下进行。
2. 通过 CO₂ 窒息法处死动物，并将眼球摘除至含有预先氧合的细胞外溶液的培养皿中。
3. 用针刺穿角膜，并使用眼科剪在角膜与巩膜交界处将其剪除。
4. 使用 #5 镊子移除晶状体。用镊子在巩膜上轻轻撕开一小口，切断视网膜与巩膜交界处的视神经。小心地将巩膜从视网膜上完全剥离。
5. 使用 #5 镊子去除透明的玻璃体；去除后，玻璃体会呈现为黏附在镊子上的凝胶状物质。将视网膜切成两半（每只动物得到 4 块），并将其保存在室温下充氧的细胞外溶液中，直至使用。
6. 准备将组织装入记录室时，取一块视网膜置于含有 500 µL 充氧细胞外溶液稀释的酶溶液中孵育。在室温（RT）下于摇床上孵育 2 分钟。
   1. 用充氧的细胞外溶液清洗视网膜组织，然后将其放入玻璃底记录室中；使用剪去尖端的塑料移液管头，以便在转移过程中避免对组织造成损伤。
7. 使用镊子小心展平组织，使感光细胞层朝下。用移液器吸除多余液体。使用带尼龙网的铂金环固定组织。
   注意： 该方法也可用于制备标记的无长突细胞和双极细胞，以进行RNA分离。
8. 用充氧的细胞外溶液充满记录室，并将其安装到显微镜载物台上。以 2–4 mL/min 的流速持续灌注充氧的细胞外溶液。

3. GFP+ 视网膜神经节细胞的可视化与靶向定位（10 分钟）

注意： 本节中的所有操作均应在暗红光照明下进行

1. 开始前，使用微电极拉制仪将玻璃毛细管（外径[OD]：1.2 mm，内径[ID]：0.69 mm）拉制成用于电生理记录的玻璃微电极。电极制备采用以下程序（请注意，参数需根据实际情况调整以获得理想阻值，不同拉制仪及不同玻璃材质下参数可能有所差异）：加热：斜升+10；拉力：0；速度：23；延迟：1；气压：500；程序循环：5次。确保电极尖端直径约为1 µm，用于靶向较大细胞时阻值为2–4 MΩ，靶向较小细胞时阻值为5–7 MΩ。
2. 使用红外微分干涉差（IR-DIC）显微技术观察神经节细胞层（图1A). 使用落射荧光（~480 nm）鉴定绿色荧光蛋白（GFP）阳性视网膜神经节细胞（RGCs）图1B).
3. 在微分干涉相差显微镜（DIC）下定位含有细胞内液的移液管。在放大器上施加轻微的正压并归零电压偏移。
4. 将玻璃微电极轻压在GFP+细胞上，施加负压以在电极与细胞膜之间形成吉欧姆（GΩ）封接。施加测试电压指令阶跃例如， 5 mV）以监测封接电阻。形成稳定封接后，施加短暂的负压脉冲破裂细胞膜，从而获得全细胞记录模式。
5. 等待1-2分钟，使细胞的树突充分填充荧光示踪剂。
   注意： 可通过荧光显微镜观察细胞形态来进行形态学分类图1C）。对于表达黑视蛋白的视网膜神经节细胞（RGCs），通过在落射荧光照明下观察被荧光示踪剂填充的树突，并确定其树突在内丛状层中是否分布在远离胞体的OFF亚层（M1型ipRGCs），或靠近节细胞层的ON亚层（M2型ipRGCs），从而可视化其树突分层特征。 & M4 ipRGCs），或两者兼有（M3 ipRGCs）。该特征结合胞体大小（M4的胞体明显大于其他所有ipRGC亚型），可用于鉴定细胞类型。因此，该技术可实现细胞类型的鉴定 体外 在RNA提取之前。该方法可根据涉及树突形态或细胞生理学的其他细胞类型鉴定方案进行调整。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
焦碳酸二乙酯（DEPC）	Sigma Aldrich	D5758
Alexa Fluor 594 肼	Invitrogen	A10442
培养皿（35 mm 直径）	Thermo Fisher Scientific	153066
眼科剪刀	Fine Science Tools	15000-00
#5 镊子	Fine Science Tools	11252-30
玻璃微量移液管	Sutter	BF120-69-10
微量移液管拉制仪	Sutter		P-1000 水平移液管拉制仪
1 mL 注射器	Fisher Scientific	14-823-2F